Summary
אנו מדגימים
Abstract
מיקוד ועידון של תחזיות RGC אל המוח התיכון, היא מערכת מודל פופולרי ורב עוצמה ללימוד כיצד דפוסים מדויקים של טופס קישוריות עצבית במהלך ההתפתחות. בעכברים, תחזיות retinofugal מסודרים בצורה טופוגרפית ובצורה ספציפית עין שכבות בגרעין הברכיתי הרוחב (dLGN) של התלמוס ואת Colliculus מעולה (SC). הפיתוח של דפוסים אלה המדויק של תחזיות retinofugal יש בדרך כלל נחקרה על ידי תיוג אוכלוסיות RGCs עם צבעים קליעים נותבים ניאון, כגון peroxidase חזרת 1-4. עם זאת, שיטות אלו גס גם כדי לספק תובנה לגבי שינויים התפתחותיים אצל אדם מורפולוגיה RGC סוכת axonal כי הם הבסיס של היווצרות המפה retinotopic. הם גם אינם מאפשרים מניפולציה גנטית של RGCs.
לאחרונה, electroporation הפכה שיטה יעילה עבור מתן שליטה במרחב ובזמן מדויק עבור משלוח של מולקולות טעונים לתוך הרשתית 5-11. שוטפים ופרוטוקולים electroporation ברשתית אינם מאפשרים מניפולציה גנטית מעקב אחר תחזיות retinofugal מקבץ קטן של יחיד או RGCs בעכברים לאחר הלידה. נטען כי לאחר הלידה ב electroporation vivo אינה שיטה מעשית עבור transfecting RGCs מאז יעילות תיוג הוא נמוך ביותר, ולכן דורש מיקוד בגילאים עובריים, כאשר אבות RGC עוברים בידול ריבוי 6.
בסרט זה אנו מתארים בפרוטוקול electroporation vivo למסירה ממוקד של גנים, shRNA ו dextrans ניאון RGCs Murine אחרי הלידה. טכניקה זו מספקת חסכוני, מהיר פלטפורמה קלה יחסית לסינון יעיל של גנים מועמדים מעורב בכמה היבטים של ההתפתחות העצבית כולל נסיגת האקסון, מסתעפת, למינציה, התחדשות היווצרות הסינפסה בשלבים שונים של פיתוח מעגל. לסיכום נתאר כאן כלי רב ערך אשר יספקו תובנות נוספות המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח המפה חושית.
Protocol
1. ציוד הקמה עבור electroporation
- אלקטרודות: אנו שונה דומון # 5 מלקחיים שישמש אלקטרודות.
- הפרד להתפרק מלקחיים.
- חוט הלחמה בקצה הרחב של כל שן. עוטפים את החוט המצורף חודי עם סרט בידוד להשאיר כ 25-30 מ"מ של קצה חודי חשוף.
- שים את מלקחיים שונה בחזרה יחד עם spacer כלשהו פלסטיק מתאים (למשל כפתור) בין שתי שיני לספק פעולה האביב.
- ציוד חשמלי: אנו משתמשים ממריץ חשמל כדי לספק פולסים הנוכחית electroporation ועל צג האוסילוסקופ ושמע לאשר את waveform ומספר פולסים מועבר.
- חבר את הכבל של שן אחת מלקחיים אל דוושת רגל אשר מחובר גם בסדרה עם ממריץ. דוושת רגל משמש מתג. מדוכא כאשר הוא משלים את המעגל עבור electroporation.
- חבר את הכבל של שיניים אחרות ממריץ החשמל.
- חבר את ממריץ את האוסילוסקופ לפקח אודיו.
- Micropipette ו מזרק הגדרת: אנו משתמשים חדה pipettes זכוכית משך ומערכת השנייה Nanoinject מזרק כדי להזריק כמויות קטנות מאוד של צבע או פתרון ה-DNA ישירות לתוך הרשתית.
- הר על מערכת ההזרקה micromanipulator 3-ציר.
- משוך pipettes זכוכית עם להתחדד ארוך טיפ קטן.
- חזרה למלא את משך פיפטה עם שמן מינרלי מאובטחת ההזרקה (לפרטים ראה Nanoinect ידני II הוראה).
- בעזרת מספריים microdissecting חדה חתך את קצה פיפטה, יצירת פתח קטן (~ 2-3 מיקרומטר).
- מלאו את פיפטה עם כמות הרצויה של פתרון באמצעות הזרקה קצה פיפטה. עוד על שלמות קצה מחזיקה, היא יכולה לשמש עבור זריקות ובעלי חיים רבים.
הערה: i) ודא פתרון הזרקת דיו טעון את הטיפים כזה שמן מינרלי backfilled לא מוזרק לתוך העין. ii) II Nanoinject המערכת ואת ציוד אלקטרוני מסוים בשימוש וידאו זה לא קריטי להשגת תיוג מוצלח של RGCs. זריקות עשה עם התקנים אחרים כגון picospritzer ו electroporation עם לגירוי נפוצים אחרים יכולים לשמש גם כדי RGCs התווית.
2. פתרונות פלסמיד עבור תיוג RGC
- עבור תיוג אשכולות קטנים של RGCs: אנו משתמשים בקידוד EGFP לבנות (~ 2-3 מיקרוגרם / μL) משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק) תחת שליטה של מקדם החטיבה (β-אקטין עוף עם האמרגן מיידית CMV משפר מוקדם). EGFP מתויג רצף palmitoylation של GAP-43 (גידול הקשורים חלבון 43) מיקוד אותו קרום התא (mut4EGFP) 12. לבנות זה נקרא pCAG-gapEGFP.
- עבור תיוג תא בודד: אנו משתמשים בשילוב של שני המבנים. וקטור הראשון הוא מקדם החטיבה נהיגה Cre recombinase (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] פלסמיד 13,775) 13 ואת וקטור השני מכיל קלטת STOP floxed ואחריו קרום ממוקד EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) משמש בריכוז כ 1,000-10,000 פי נמוך יותר pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), כליאת ביטוי EGFP חזקה במספר קטן של תאים (מכוח הנמוך יחסית pCAG-Cre ריכוז).
3. הזרקת הרשתית ואת פרוטוקול electroporation
- יום אחרי לידה 0 (P0) כדי גורים P5 מורדמים באמצעות היפותרמיה, ואילו עכברים מבוגרים מאשר P5 מורדמים עם זריקה intraperitoneal (0.7 מ"ל / ק"ג) של קוקטייל של קטמין (4.28 מ"ג / מ"ל), xylazine (0.82 מ"ג / מ"ל) ו acepromazine (0.07mg/ml) 14.
- לעקר את כל מכשירי ניתוח וטיפים אלקטרודה מעקר חרוז חם. מגניב בהמשך הן מלוחים סטריליים לפני השימוש כדי למנוע נזק תרמי לעין.
- המקום העכבר תחת בהיקף לנתיחה ומיקום ההזרקה.
- עבור עכברים צעירים יותר P14 (לפני פתיחת העין), בניתוח לפתוח את העפעף על ידי חיתוך לאורך כל אורכו של פתיחת העפעף עתידי עם מיקרו ב באביב מספריים לנתח.
- הפוך את גלגל העין באופן חלקי לבלוט על ידי הפעלת לחץ בעדינות סביב העין בקצות מלקחיים ג.
- החזק את העין במקום על ידי צובט בעדינות את העור סביב העין.
- התאם micromanipulator ולהביא פיפטה קרוב גלגל העין.
- לחצו על דוושת רגל, אשר מחובר אל השני Nanoinject המערכת, לגרש כמה טיפות של תמיסת הזרקת ובכך לוודא כי פיפטה לא סתומים.
- עם יד אחת מייצבת את גלגל העין, הזז את micromanipulator כזה קצה פיפטה זכוכית חודרת דרך אפיתל הפיגמנט ברשתית ונכנס הרשתית.
- הזרק desכמות ired של פתרון על ידי לחיצה על דוושת רגל למערכת Nanoinject השנייה. לדוגמה, כדי תווית RGCs אחד שאנחנו עושים זריקה אחת של 2.3-4.6nL.
- לסגת פיפטה ובזהירות מקום טיפים אלקטרודה ישירות על הזריקה ומדכאים הדוושה ברגל ממריץ כדי להשלים את המעגל ואת electroporate את העין. אנו משתמשים בדרך כלל פולסים מרובע עם הגדרות של כוח 25V, משך 50msec, 1sec מזה. 10 פולסים (5 פולסים של הקוטביות אחד) מוחלים על עכברים פולסים מבוגר P4 ו - 6 (3 פולסים של הקוטביות אחד) מוחלים עבור P0 לעכברים P3.
- דחף בעדינות בחזרה לשקע העין וליישם משחת עיניים סטריליות מעל העפעפיים לחתוך.
- חיות מניחים על משטח חום מבוקר טמפרטורה על התאוששות מלאה, כולל rewarming ניידות נאותה, לחזור חיה לאמא שלהם.
- צג בעלי חיים כל 12 שעות לכל סימן של מצוקה וכאב, או אי נוחות, כגון אובדן ניידות, יציבה כשל לא נורמלי או החתן. סיבובים חוזרים ונשנים של, זריקות הרדמה electroporation לא צריך להיות מבוצע על החיה אותו.
4. הערות
- שיטת הזרקה המתואר וידאו זה הוא הזרקה "עיוורת". אפשר לדמיין את כמות ומיקום הזרקה כשעובדים עם עכברים לבקנים ופתרונות בצבע (DiI או פתרון פלסמיד עם כמויות זעירות של כחול מהיר). עם זאת, עם זני עכברים פיגמנט המיקום זריקה לא ניתן דמיינו ישירות ומכאן שקשה לתאר מילולית אם אחד הגיע המיקום המיועד רשתית או כמה רחוק צריך להזיז את פיפטה למקד את השכבה RGC במיוחד. לכן, אנו ממליצים למשתמשים חדשים קודם להתחיל עם זריקות DiI בעכברים לבקנים מאז הזרקות אלה ניתן דמיינו מיד ברשתית ואת תיוג התחזיות RGC אל הרשתית והמוח ניתן להשתמש כדי להעריך את איכות הזריקה. הכן DiI 10% N, N-Dimethylformamide (100%) זריקות מוקד. משתמשים לאחר הליך זה הוא שולט צריכים להיות מסוגלים בעקביות היעד RGCs עם פתרונות ה-DNA ברור פלסמיד בעכברים פיגמנט.
- השיטה של הזרקת המתואר וידאו זה יכול לשמש כדי להפוך מוקד זריקות DiI לתייג אוכלוסיות קטנות של תאים ללמוד retinotopy (4.6nL תוויות כמה מאות RGCS) 14 ו RGCs תווית בתפזורת עם fluorophores (Alexa555, 488 וכו ') כדי מצומדות למקטע כולרה ב רעלן ללמוד העין ספציפי הפרדה, למעט השלב electroporation ב # 10 לעיל. נפח מקסימלי הזריקה סך של 2-3uL לעכברים מבוגר P14 ו 1-2uL לעכברים צעירים יותר P14 של כל פתרון מומלץ.
- Pipettes ניתן backfilled עם פתרונות להיות מוזרק ואחריו למלא את משבצות עם שמן מינרלי לפני הרכבה פיפטה על מזרק ושבירת קצה. זה שימושי במיוחד בעת השימוש ריכוז גבוה DNA פתרונות (~ 6ug/uL), אשר כללי צמיגה וקשה לטעון מקצה פיפטה.
- אם פיפטה זכוכית הופך סמיך, לנגב היטב את קצה פיפטה במקלון צמר גפן טבול במים פתרונות דנ"א אתנול (100%) עבור צבע (DiI) פתרונות.
- לאחר הזרקת בעיניים, לסגת קצה פיפטה של גלגל העין ולחץ על דוושת רגל להזריק שוב. זה כדי לאשר את קצה לא מקבל סתומים במהלך תהליך ההזרקה. אם לא הפתרון הוא לוותר, זה סביר כי הזריקה לא הייתה מוצלחת. עם זאת, זה לא צריך לקחת כסימן מוחלט כי הזריקה לא הייתה מוצלחת. הנסיין יכול להזריק את העין שוב אם אתרי הזרקה מרובות וסימון של מספר גדול יותר של תאים הרצוי.
- עבור תיוג RGCs יחיד, קבע את מהירות הזריקה להאט על קופסת השליטה Nanoinject. עוד דבר זה מפחית את כמות פתרון מוזרק לתוך הרשתית כמערכת לוקח יותר זמן הגדרה זו כדי לוותר על הפתרון ובמקביל קצה pipettes זכוכית מתבצע חזר מהר מן העין.
- Electroporation של יום הלידה 0-3 (P0 ל P3) עכברים דורש טיפול נוסף מאז קל מאוד לפגוע בעין (זה הופך להיות ברור אחרי כמה ימים של התאוששות, כאשר העין היא במופגן קטן יותר מהרגיל). צמצום מספר פעימות מתח להחיל מומלץ לעכברים בילוד מוקדם. לאחר P4, העיניים הם עמידים יותר נזק electroporation.
- בקרום הניסיון שלנו גרסאות ממוקד של EGFP או RFP ("gapEGFP", ראה 12) עדיפים בהרבה על ה-GFP ללא שינוי לבחינת תחזיות retinofugal למוח. עם זאת, pCAG-tdTomato, שאין לה קרום שינוי המיקוד, גם עובד היטב (איור 1E). בנוסף, צבעי ניאון dextran מצומדות יכול לשמש גם כדי RGCs התווית באמצעות פרוטוקול electroporation שתוארו לעיל.
- בדרך כלל, 9 מתוך 10 זריקות תוביל RGCs שכותרתו, אם כי רק כ -15% של זריקות עם הגישה הפלסמיד יהיה כפולהתוצאה RGC רק אחד להיות מתויג. מספר מקרים מוצלח יכול להיות מוגברת על ידי הזרקת DNA במקומות רבים בעין אחת או על ידי הזרקת פלסמידים קידוד חלבוני ניאון שונים לתוך כל עין.
5. נציג תוצאות
RGC תיוג נצפתה בכל הגילאים, החל P2 ל P25, עם תיוג EGFP ב RGCs על ידי 24 שעות לאחר electroporation ומתוחזק ביטוי במשך לפחות שלושה שבועות לאחר transfection.
דנדריטים שכותרתו fluorescently (איור 1 א ', ב') סוכות axonal (איור 1F) של RGCs יחיד ניתן דמיינו בבהירות משוחזר.
מלבד RGCs, טכניקה זו יכולה לשמש תווית אחרים סוגי תאים ברשתית כגון תאים אופקיים, תאים דו קוטבית שונים תת תא amacrine (תרשים 1C)
שיטה זו אינה מפריעה כמובן הזמן הרגיל של עידון מפה ויזואלית כפי שעולה retinotopy נורמלי SC (איור 1E).
בכל גיל, בערך 90% מהמקרים, זריקת נפח קטן (~ 2.3-4.6nL) של pCAG-gapEGFP הביא לידי ביטוי RGCs מעטים (איור 1D).
ב 15% של הניסויים באמצעות זריקה אחת של pCAG-Cre pCAG ו-LNL-gapEGFP פלסמידים שילוב לכל חיה, הוביל תיוג נוירון יחיד ברשתית כולל RGCs (איור 1A, B, D) סוגי תאים אחרים כגון amacrine תאים (תרשים 1C).
איור 1 - א ', ב' דוגמאות של EGFP שכותרתו אחד התאים הגנגליון ברשתית (ראש החץ מצביע על האקסון) ברשתית שטוח הר ביום שלאחר הלידה 14 (P14) C. דוגמה של תא אחד מהספרים amacrine P8 ב ד.. . מקבץ של נוירונים EGFP רשתית שכותרתו כולל RGCs ותאי amacrine ברשתית שטוח הר ב P14. RGCs א הגבי ו הגחון בעין ימין היו electroporated ומסומן עם EGFP ו RGCs הזמני הגחון בעין שמאל היו electroplated ו שכותרתו עם tdTomato ב P1. אזורי היעד (כוכביות) שיצרו RGCs שכותרתו ניתן לראות את המיקום הנכון טופוגרפית שלהם SC ב P9 (כל הר, מתאר לבן). דוגמה של פ EGFP בודד שכותרתו RGC סוכת (2-D הקרנה) בבית קטע sagittal (250 מיקרומטר עבה) של SC (קו מקווקו). לשם הבהירות, תמונות (ד) ו - (F) הומרו לגווני אפור ו הפוכה. סולם ברים (מיקרומטר): (א) - (ד), (F): 100: (E): 500
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בסרטון הזה אנחנו מדגימים בפרוטוקול electroporation vivo כי התוצאות תיוג של אשכולות יחיד או קטן של נוירונים ברשתית אצל עכברים לאחר הלידה עם בונה DNA קידוד חלבוני ניאון. אשכולות קטנים של תחזיות RGC שכותרתו fluorescently את dLGN ו SC לשכפל דפוסי השלכה דומה כמו במחקרים קודמים באמצעות תיוג RGC עם צבעים lipophilic, המציין electroporation שלא להפריע נורמלי עידון RGC סוכת האקסון. יש לנו שימוש בפרוטוקול זה על מנת לנתח את המפה retinotopic ברמה של שני יחידים וקבוצות של RGCs במודלים של העכבר שונים עם מפות חזותי נורמלי שיבשו.
התוצאות שלנו מראות כי נוירונים ברשתית הבדיל ברשתית לאחר הלידה ניתן transfected מהימן משתמש electroporation vivo. לאחר הלידה in vivo electroporation פרוטוקול המתואר כאן מאפשר תיוג סימולטני מניפולציה גנטית של RGCs באופן מוגבל במרחב ובזמן. אנו מדגימים תיוג של נוירונים ברשתית באמצעות שילוב של פלסמידים קידוד Cre recombinase והכתב פלורסנט קדמו רצף STOP floxed. נוירון יחיד עקבי transfection מושגת באמצעות ריכוז נמוך מאוד יחסית Cre פלסמיד פלסמיד הכתב. בהשוואה ב electroporation ברחם, שיטה זו היא פחות פולשנית ולא להפריע מוקדם הדרכה אירועים האקסון כגון מעבר לעבר התצלובת הראייה. בנוסף, ביחס גישות ויראלי, זה דורש פחות זמן ביטוי גנים חזק והוא פחות רעיל. כלי זה מספק אמצעי יעיל ומהיר לבחינת מנגנוני תאית ומולקולרית בתיווך עידון ההבשלה של תחזיות retinofugal הן ברמה המבנית הסינפטי ברוטו דרך misexpression או להפיל של גנים מועמדים. RGCs המיקוד ב vivo עם תווית פלורסנט גם ניתן להשתמש בהם in vivo שני הפוטונים הדמיה של RGC האקסון הדינמיקה ואת המאפיינים הפיזיולוגיים שלהם. לסיכום, יכולת גנטית היעד לדמיין RGCs in vivo לאחר הלידה יסייע נוסף להבהיר את המנגנונים השולטים תאית ומולקולרית פיתוח מעגל במערכת העכבר חזותיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
PCAG-gapEGFP הפלסמיד היה מתנה ד"ר ס מקונל (סטנפורד, קליפורניה). pCAG-tdTomato פלסמיד הייתה מתנה מ ד"ר פלר (ברקלי, CA). אנו מודים ד"ר אדוארד Ruthazer עבור מציע את השימוש באסטרטגיה של שתי פלסמיד תיוג תא בודד ואן Schohl (Montreal, QC) עבור אימות שני פלסמיד Cre / loxP אסטרטגיה בלימודי טייס וחברי Crair מעבדה לקבלת תמיכה טכנית. נתמך על ידי R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) ו-NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
