Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells

Summary

Immunzytochemie ist eine leistungsfähige Methode, um die Präsenz, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse in kultivierten Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, mit denen man Antikörper zu schonen und das Beste aus der eigenen Färbung wird.

Abstract

Immunzytochemie ist eine sehr mächtige und ziemlich einfache Methode zur Bestimmung der Gegenwart, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse, am häufigsten ein Protein, in kultivierten Zellen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, ermöglichen es Forschern, primäre und sekundäre Antikörper zu erhalten, während sich hohe Qualität, reproduzierbare qualitative und quantitative Daten aus ihrer Färbung wird. Es gibt zwei Aspekte dieses Protokoll, um die Lautstärke des Antikörpers notwendig für die Färbung sparen helfen. Zum einen werden die Zellen auf kleine, runde Deckgläser, dass in Vertiefungen einer Gewebekultur Platte gelegt angebaut werden. Nach der Fixierung können die Zellen auf Deckgläsern aus den Vertiefungen der Platte entfernt werden. Für Antikörper-Färbung wird das Deckglas mit Zellen auf einen kleinen Tropfen Antikörperlösung auf Parafilm invertiert und ist mit einem zweiten Stück Parafilm Austrocknen zu verhindern abgedeckt. Mit dieser Methode ist nur ~ 25 ul Antikörper-Lösung für jedes Deckglas (oder Muster) zu gebeizt werden musste. Dieses Protokoll beschreibt Immunfärbung der menschlichen neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), kann aber auch für viele andere Zelltypen verwendet werden.

Protocol

Tag 1: Vorbereiten deutschen Deckgläser und Seeding Cells

Hinweis: Deutsch Deckgläser sind oft besser zur Kultivierung von primären neuralen Stammzellen und Neuronen. Wir verwenden die folgenden Reinigungs-Protokoll, um die Zelladhäsion und Verbreitung zu verbessern. Position Deckgläser in einem kleinen Gestell, das flüssige Zugang zu beiden Seiten des Deckglases ermöglicht. Zunächst inkubieren Deckgläser in 1% Liquinox für 10 Minuten, gefolgt von 3 Waschschritten mit deionisiertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass keine Seifenblasen bleiben. Als nächstes inkubieren rutscht in 1M HCl für 30 Minuten, gefolgt von 3 Waschschritten mit deionisiertem Wasser. Dry Deckgläschen bei 65 ° C über Nacht. Transfer Deckgläschen in eine Glasschale und Autoklaven zu sterilisieren.

1. In einer Gewebekultur Kapuze, Ort, sterile Deckgläschen in ein entsprechend großes Loch-Platte.
   
   
2. Coat Deckgläser mit Laminin für die Zelladhäsion. Inkubieren Deckgläschen in 10 pg / ml Poly-D-Lysin (PDL) in sterilem Wasser für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen PDL und inkubieren Deckgläschen in 20 ug / ml Laminin in EMEM für 4 Stunden oder über Nacht in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator.
   
   
   
   1. Hinweis: Beachten Sie die Passagierung Nervenstammzellen Artikel ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) und die Counting Nervenstammzellen Artikel ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) zu lernen, wie resuspendieren und zählen hNSPCs.
      
      
3. Spülen Laminin-beschichtete Deckgläser mit PBS-und Samenzellen in jedes Deckglas-haltige auch bei einer bestimmten Dichte (wir verwenden oft eine erste Plattierungsdichte von 100.000-300.000 Zellen / ml für Zellen, die wir für Immunfärbung plating).
   
   
4. Legen Sie Platte in 37 ° C Gewebekultur-Inkubator und erlauben Zellen auf Deckgläser (in der Regel ein Minimum von 4 Stunden ist erforderlich) einzuhalten.

Tag 2: Befestigung, permeabilisierenden, Blocking und Hinzufügen von primären Antikörpers an Cells

Hinweis: Wir verwenden die folgenden 4% Paraformaldehyd Fixativ zu Zellmorphologie zu bewahren. Das Rezept enthält eine pH Übergang zu ermöglichen Paraformaldehyd in Lösung zu gehen. Wir bevorzugen diese Methode anstelle der Nutzung von Wärme zu Paraformaldehyd auflösen, weil höhere Temperaturen zur Bildung von Ameisensäure, die Hintergrundfärbung erhöhen kann, wenn mittels Fluoreszenz führen kann. Einige Komponenten des Fixativ zur Bewahrung des Zytoskeletts Struktur (MgCl ₂ und EGTA), während andere helfen, die allgemeine Morphologie (Saccharose) zu halten.

4% Paraformaldehyd-Fixativ für Zellen

Reagenzien und Schritte aus:	Betrag für 100 ml Fixativ:
MilliQ Wasser	75 ml
Paraformaldehyd (abwiegen im Abzug)	4 g
10N NaOH, umrühren und tropfenweise, bis die Lösung löscht	nach Bedarf
10X PBS	10 ml
1M MgCl 2	0,5 ml
0,5 M EGTA	2 ml
Sucrose	4 g
6N HCl, titriert auf pH 7,4	nach Bedarf
MilliQ Wasser	bringen, um 100 ml
Lagerung bei 4 ° C für bis zu 1 Woche. Warm bis 37 ° C vor dem Einsatz

1. Auf der Bank, entfernen Sie die Medien und fügen vorgewärmt Fixativ. Inkubieren für 5-15 Minuten (je nach Antigen nachgewiesen werden soll, verwenden wir im allgemeinen 10 Minuten). Führen Sie dieses und die folgenden Schritte bei Raumtemperatur.
   
   
2. Entsorgen Sie die Fixierlösung in einen geeigneten Behälter, wie viele Institutionen Paraformaldehyd Griff als gefährlicher Abfall. Wash Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten Zeit. Beim Entfernen von Lösungen aus den Zellen, darauf achten, dass Saug-trocknet nicht aus den Zellen. Auch immer die nächste Lösung zur Hand, um die Zellen vor dem Entfernen der Lösung, die Mäntel ihnen so Zellen nicht trocknen gelassen hinzuzufügen.
   
   
3. Wenn das Antigen von Interesse ist im Inneren der Zelle, muss die Zellmembran durchlässig gemacht Eingabe des Antikörpers zu ermöglichen. Um permeabilisieren Zellen, mit einem frischen 0,3% Triton X-100-Lösung in PBS. Pipette langsam, weil Triton ist zähflüssig, und vergewissern Sie sich das Waschmittel vollständig in PBS, bevor Sie die Zellen aufgelöst. Permeabilisieren Zellen für 5 Minuten, durch Waschen der Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten Zeit gefolgt.
   
   
4. Die Zellen müssen mit einem Blockierungsmittel, um unspezifische Bindung des Antikörpers zu verhindern behandelt werden. Wir verwenden Rinderserumalbumin (BSA) als Blockierungsmittel. Die Sperrung wird durch Lösen von 5% BSA in PBS hergestellt (auf einer Wippe oder Rotator, weil es an der Zeit zu lösen hat), dann Filterung der Solution mit 0,45 um Spritzenfilter. Block-Zellen in 5% BSA / PBS Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur.

Verdünnen Sie den Primärantikörper (was hoffentlich die spezifisch für das Protein von Interesse) zu einem vorher festgelegten Konzentration in 1% BSA / PBS (hergestellt durch Verdünnung von 5% BSA / PBS). Legen Sie verdünnten primären Antikörper (30 ul pro 25 mm Deckglas, 20 ul pro 18 mm Deckglas, 15 ul pro 12 mm Deckglas) auf einer Glasplatte mit Parafilm abgedeckt. Nehmen Sie den Deckglas mit fixierten Zellen, invertieren, so dass die Zellen nach unten zeigen, und legen Sie es über die Antikörper-Lösung, so dass die Zellen in Kontakt mit dem Antikörper sind. Legen Sie einen zweiten Parafilm Streifen über die gesamte Konstruktion. Inkubation bei 4 ° C über Nacht.

Tag 3: Wasch-, Sekundär-Antikörper Inkubation, Kernfärbung und Montage

1. Entfernen Sie vorsichtig die obere Parafilm-Streifen und abholen Deckglas, Invertzucker, und setzen Sie ihn wieder in die Platte mit PBS in jede Vertiefung für wäscht, so dass die Zellen nach oben.
   
   
2. Wash Zellen 3 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten Zeit.
   
   
3. Wählen Sie einen sekundären Antikörper, der den primären Antikörper erkennen wird, zum Beispiel, wenn der primäre Antikörper in Kaninchen hergestellt wurde, der sekundäre Antikörper sollten Kaninchen IgG erkennen. Achten Sie darauf, auch mit den Antikörper-Isotypen (IgG, IgM, etc). Bei Verwendung mehrerer primärer Antikörper, sicherzustellen, dass sie aus verschiedenen Arten oder Isotypen, und planen Sie mit verschiedenen Markern an den sekundären Antikörper nachzuweisen. Zum Beispiel könnten Sie eine Anti-Kaninchen sekundären gekoppelt mit einem roten Fluorophors mit einem Anti-Maus-sekundären gekoppelt mit einem grünen Fluorophor verwenden. Inkubieren Zellen in den sekundären Antikörper-Lösung verdünnt, um eine geeignete Konzentration in 1% BSA für 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur mit der gleichen Technik wie für die primäre (Schritte nicht im Video gezeigt). Das Volumen des sekundären Antikörpers für die Inkubation benötigt werden etwas größer als die für den primären Antikörper, wenn die sekundäre als Glycerin-Lösung (40 ul pro 25 mm Deckglas, 30 ul pro 18 mm Deckglas, 25 ul pro 12 mm Deckglas) gespeichert ist .
   
   
   • Hinweis: Wenn Sie unter Verwendung von fluoreszierenden Moleküle werden an den sekundären Antikörper sichtbar zu machen, muss die Probe vor Licht geschützt werden, wenn der sekundäre Antikörper zugegeben wurde. Inkubieren im Dunkeln oder in einer Folie abgedeckt Platte.
     
     
4. Entfernen Sie vorsichtig das Deckgläschen aus der Parafilm wie für den primären Antikörper beschrieben. Wash-Zellen 2 mal mit PBS, jeweils 5 Minuten Zeit, eine 1-minütige Inkubation in 2 pg / ml Hoechst nuklearen in PBS verdünnt Fleck (wenn eine nukleare Gegenfärbung bevorzugt wird) gefolgt. Wenn der Hoechst-Färbung ist alt und das Signal zu schwach ist, können Sie erhöhen die Inkubationszeit und / oder die Konzentration. Nach der Inkubation mit Hoechst, waschen 1 Mal mit PBS für 5 Minuten.
   
   
5. Die Deckgläser sollten auf einer Folie mit Montage Medien zur Visualisierung auf einem Mikroskop montiert werden. In Fällen, in denen ein fluoreszierendes Molekül für die Visualisierung des sekundären Antikörpers verwendet wird, sollte die Montage Medien enthalten Wirkstoffe zur Minimierung Bleichen. Wir verwenden Vectashield als Montage-Medien für die Fluoreszenz. Legen Sie eine geeignete Größe Tropfen Vectashield auf einen Objektträger (12 ul pro 25 mm Deckglas, 6 ul pro 18 mm Deckglas, 3 ul pro 12 mm Deckglas).
   
   
6. Sorgfältig nehmen die Deckglas und spülen Sie den Rücken mit VE-Wasser, Salze (aus dem PBS) zu entfernen. Abtupfen überschüssige Wasser auf einem Kimwipe oder Papiertuch, und lag auf dem Tropfen Vectashield mit Zellen nach unten. Legen Sie das Deckglas auf einen Winkel und lassen Sie sie langsam hinab, um Luftblasen zu vermeiden. Beschriften Sie die Folie mit dem Datum und einer Probe Informationen.
   
   
7. Lassen Sie die Objektträger mit Deckgläsern, um zu trocknen (im Dunkeln), dann Absaugen überschüssigen Vectashield aus der ganzen Deckglas Rand. Das Deckglas Kanten können nun mit Nagellack versiegelt werden, wenn gewünscht (besonders nützlich, wenn Deckgläser auf einem inversen Mikroskop wird eingesehen werden). Wir in der Regel speichern unsere Folien in einer -20 ° C Gefrierschrank.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Immunfärbung Verfahren für hNSPCs dass das Volumen des Antikörpers notwendig minimiert und verleiht zuverlässige Zellfärbung. Das beschriebene Verfahren ist am besten für die intrazelluläre Antigene, kann aber geändert werden, um Zelloberflächenmoleküle Flecken oder Verfärbungen des Zytoskeletts zu verbessern.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips	Tool	Carolina Biological	WW-63-3029	12,15,18, 22, 25 mm coverslips available
Liquinox phosphate-free detergent	Reagent	Sigma-Aldrich	Z273279	very viscous
Poly-D-lysine hydrobromide	Reagent	Sigma-Aldrich	P7280
Laminin, natural mouse	Reagent	Invitrogen	23017-015
EMEM (1X)	Reagent	Mediatech, Inc.	MT-10-010-CV	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
24 well plate	Tool	Fisher Scientific	08-772-1
Triton X-100	Reagent	Fisher Scientific	BP151-500	very viscous
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	P6148	potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form
Bovine Serum Albumin, IgG-free	Reagent	Jackson ImmunoResearch	001-000-161
H–chst 33342	Reagent	Invitrogen	H-1399
Vectashield	Reagent	Vector Laboratories	H-1000	viscous