Кремний Микрочипы для манипулирования межклеточных Взаимодействие

Summary

В этой статье описывается экспериментальный подход для динамического регулирования межклеточных взаимодействий между прилипшие клетки на микрометрической шкалой. Манипуляция межклеточной коммуникации между гепатоцитами и стромальных клеток показано. Разработана платформа позволяет исследование межклеточных взаимодействий в различных биологических процессов, включая разработку и патогенез.

Abstract

Роль сотовой микроокружения признается решающее значение в определении судьбы и функционирование клеток практически во всех тканях млекопитающих от разработки к злокачественной трансформации. В частности, взаимодействие с соседними стромы был вовлечен в множество биологических явлений, однако обычные методы ограничивают возможность допросить пространственные и динамические элементы такого взаимодействия.

В Микромеханические культуры реконфигурируемых (RC), мы используем Micromachined кремниевой подложке с движущимися частями, для динамического контроля межклеточных взаимодействий с помощью механических репозиционирования. Ранее этот метод был применен для исследования межклеточных взаимодействий во взаимодействии культур гепатоцитов и не паренхиматозных клеток, демонстрируя зависящих от времени взаимодействия и ограниченный диапазон для растворимых сигнализации ^1.

Здесь мы подробно описывать подготовку и использование системы КР. Мы начнем с демонстрации обработки устройство деталей с помощью пинцета, в том числе исполнительных между разрывом и контактных конфигураций (клеточных популяций, разделенных узкой 80-мкм разрыв, или в прямой интимный контакт). Далее мы подробно процесс подготовки субстрата для культуры, и многоступенчатый процесс посева ячейки, необходимых для получения сливной монослоев клеток. Использование живых микроскопии, мы затем проиллюстрируем в реальном времени управлять клеток между различными возможными экспериментальных конфигурациях. Наконец, мы демонстрируем шаги, необходимые для того, чтобы восстановить поверхности устройства для повторного использования: толуол и пираньи очистки, полистирол покрытия, и лечения кислородной плазмы.

Protocol

Подготовка культурах клеток:

1. Начните с кремнием части покрыты плазмы обработанных полистирола.
2. Пальто частей с соответствующими белками внеклеточного матрикса для поддержки крепления желаемого типа клеток. Для гепатоцитов, инкубировать в 50 г / мл Коллаген-1 раствора при температуре 37 ° С в течение 45 мин. Для 3T3 фибробласты, без матриц не требуется.
3. Блокировка частей комплектующих изделий в контакте конфигурации.
4. Замочите в 70% этаноле в течение минимум 10 минут для стерилизации. Промойте 2 раза в DDH ₂ O, и 1x в средствах массовой информации культуре клеток.
5. Семенной клетки в концентрации 500000 клеток / мл в подходящей культуральной среде. Используйте 1 мл в каждую лунку 12-а культуры пластины.
6. Инкубируйте в течение 1 часа, встряхивая каждые 15 мин повторно приостанавливать клетки равномерно.
7. Если сливающийся монослой не была достигнута через 1 час, аспирация суспензии клеток и повторите посев со свежим подвески. Повторяйте, пока не нужную ячейку плотность была достигнута.
8. Удалить комплектующих изделий. Передача части на свежий колодцев и инкубировать ночь, чтобы позволить клеткам придерживаться и распространение полной мере.
9. Форма совместного культур путем блокировки соответствующих частей в любой разрыв или свяжитесь с конфигурацией. Конфигурация может быть изменена в любой желаемой точке в течение культуре.
10. При изменении информации, заботиться, чтобы оставить клетки высохнуть в течение как можно меньше времени, желательно только одну-две секунды. Нарисуйте жидкости с одной стороны, и сразу же заменить носитель с помощью другой.

Обработка кремния частей для повторного использования:

1. Газа клетки путем замачивания в дезинфицирующих средств и ополаскивания водой.
2. Разрешить части до полного высыхания. Замочите в толуоле в течение 2 ч до полосы полистирола.
3. Чистая пираний в решение (1:2 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ нагревается до 120 ° C.
4. Промыть в течение 15 мин при непрерывном потоке DDH ₂ O. Если вы не собираетесь внести полистирола сразу, хранить части в воду.
5. Растворите полистирола в толуоле при 100 мг / мл. Vortex в полипропиленовые конические в течение приблизительно 1 час, или до полного растворения. Чуть более 1 мл раствора требуется для каждого 10 частей.
6. Спиновые пальто полистирола решение на отдельные части кремния при 2400 оборотов в минуту в течение 30 сек.
7. Выпекать в течение 5 ч при 120 ° C.
8. Лечить с кислородной плазмы (200 мторр, 200 Вт) в течение 1 мин.

Discussion

Эта система уникальна тем, что она позволяет пространственной организации ткани, которая будет динамически манипулировать на клеточном уровне. Следовательно, это устройство позволило ряд новых биологических экспериментов, охватывающих такие темы, как динамика межклеточной сигнализации, контакт-опосредованной по сравнению с растворимым сигнализации, решения ячейки судьбы, токсикологии, а также сотовой перекрестных помех. Это устройство должно быть широко обобщению с культурой субстрата является стандартной пластиковой культуре ткани, и система совместима со стандартными методами культуры и анализов. Поэтому мы считаем, что эта платформа будет иметь широкий интерес, как инструмент для изучения межклеточных взаимодействий между различными клетками и тканями.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).