Hücre hücre Etkileşim kurgulama için Silikon mikroçipler

Summary

Bu makale, mikrometre ölçeğinde yapışık hücreleri arasındaki hücre-hücre etkileşimleri dinamik düzenlenmesi için deneysel bir yaklaşımı açıklar. Manipülasyon, hepatosit ve stromal hücre arasındaki hücrelerarası iletişimi gösterilmiştir. Geliştirilen platform geliştirme ve patogenezinde de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerin, hücre-hücre etkileşimleri soruşturma sağlar.

Abstract

Hücresel mikroçevresinin geliştirme malign transformasyon hemen hemen tüm memeli dokularında hücre kaderi ve fonksiyon belirlenmesinde önemli bir rol olarak kabul edilmektedir. Özellikle, çevre stroma ile etkileşim biyolojik olayların bir bolluk suçlanmıştır, ancak geleneksel teknikler bu etkileşimlerin mekansal ve dinamik elemanlar sorgulamak için sınırlayabilir.

Mikromekanik Reconfigurable Kültür (RC), hareketli parçaları ile mekanik yeniden konumlandırma sayesinde hücre-hücre etkileşimleri kontrol etmek için dinamik bir Mikroişlenmiş silikon taban istihdam. Daha önce, bu yöntem, zamana bağımlı olarak ^çözünür sinyalizasyon 1 etkileşimleri ve sınırlı gösteren, hepatosit ve olmayan parankimal hücrelerin ortak kültürler hücrelerarası iletişimi araştırmak için uygulanmıştır.

Burada, RC sistemi ayrıntılı olarak hazırlanması ve kullanımı açıklanır. Biz boşluğu ve kontakt yapılandırmaları arasında tahrik de dahil olmak üzere, cımbız kullanarak aygıt parça işleme göstererek başlar (hücre popülasyonlarının 80 mikron dar bir boşlukla ayrılmış, ya da doğrudan yakın temas halinde). Sonra, kültür substratları hazırlama sürecinin ayrıntılı ve çok adım hücre Tohumlama işlemi konfluent hücre mono tabakaları elde etmek için gerekli. Canlı mikroskobu kullanarak, biz o zaman farklı olası deneysel yapılandırmaları arasında hücreler gerçek zamanlı manipülasyon göstermektedir. Toluen ve piranha temizlik, polistiren kaplama ve oksijen plazma tedavisi: Son olarak, biz, yeniden kullanım için cihaz yüzeyi yeniden için gerekli adımları göstermektedir.

Protocol

Hücre kültürlerinin hazırlanması:

1. Plazma ile tedavi edilen polistiren kaplamalı silikon parçaları ile başlayın.
2. Uygun ekstraselüler matriks proteinleri ile Coat parçaları istenilen hücre tipi eklenti desteği. Hepatositler için, 37 ° 50 g / ml Kollajen-1 çözümü ° C de 45 dakika inkübe edin. 3T3 fibroblastlar için, herhangi bir matris ihtiyaç vardır.
3. Tamamlayıcı parçaları ile temas yapılandırma parça kilitleyin.
4. Sterilize etmek için 10 dakika en az% 70 etanol içinde bekletin. Hücre kültür ortamı GKD ₂ O, 1x 2x durulayın.
5. Tohum hücrelerinin uygun kültür ortamı 500.000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon. 12-iyi bir kültür plaka her kuyuda 1 ml kullanın.
6. Eşit olarak yeniden askıya hücreler her 15 dakikada bir sallayarak, 1 saat süreyle inkübe edin.
7. Konfluent tek tabaka 1 saat sonra elde edilmemiş ise, hücre süspansiyonu ve taze bir süspansiyon ile tekrar tohumlama aspirat. Istenilen hücre yoğunluğu elde edene kadar tekrarlayın.
8. Tamamlayıcı parçaları sökün. Taze kuyu parça transfer ve hücrelerin tam olarak uymak ve yaymak için izin gece boyunca inkübe edin.
9. Boşluk veya kontakt konfigürasyonu birine uygun parçaları kilitleme Formu ortak kültürler. Yapılandırma sırasında herhangi bir kültür istenilen noktada değiştirilebilir.
10. Medya değiştirirken, mümkün olan en kısa sürede hücreleri kuru bırakmak tercihen sadece bir ya da iki saniye ilgilenir. Tek elle sıvı çizin ve diğer yandan kullanarak medya hemen değiştirin.

İşleme yeniden kullanım için silikon parçaları:

1. , Çamaşır suyu iliklerine ve su ile durulama hücreleri soyun.
2. Parçalar tamamen kurumasını bekleyin. Toluende polistiren şerit 2 saat bekletin.
3. 120 ° C ısıtılmış: piranha çözümü (H ₂ SO ₄ 01:02 H ₂ O ₂₎ Temiz
4. GKD ₂ O sürekli bir akış altında 15 dakika süreyle yıkayın Polistiren hemen yatırmak değilseniz parçaları, su saklayın.
5. 100 mg / ml toluen polistiren çözülür. Polipropilen konik, yaklaşık 1 saat ya da tamamen eriyene kadar karıştırın. Çözüm biraz fazla 1 ml, her 10 parça için gereklidir.
6. 30 sn için 2400 rpm'de bireysel silikon parçaları Spin kat polistiren çözüm.
7. 120 ° C'de en az 5 saat süreyle pişirin
8. 1 dakika boyunca oksijen plazma (200 mTorr, 200 W) ile tedavi.

Discussion

Bu sistem, dinamik hücresel seviyede manipüle doku mekansal organizasyon sağlayan benzersiz. Sonuç olarak, bu cihaz, hücrelerarası sinyalizasyon dinamikleri, iletişim aracılı karşı çözünür sinyal, hücre kaderinin kararları, toksikoloji ve hücresel crosstalk gibi konuları kapsayan bir dizi yeni biyolojik deneyler sağladı. Bu cihaz yaygın kültür substratı standart doku kültürü plastik olduğundan genellenememektedir olmalıdır ve sistemi standart kültür yöntemleri ve testleri ile uyumlu. Bu nedenle, biz bu platformda birçok farklı hücrelerin ve dokuların arasındaki hücre-hücre etkileşimi eğitimi için bir araç olarak geniş bir ilgi olacağına inanıyorum.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).