Les micropuces Silicon pour la manipulation d'interaction cellule-cellule

Summary

Cet article décrit une approche expérimentale pour la régulation dynamique des interactions cellule-cellule entre les cellules adhérentes sur une échelle micrométrique. Manipulation de la communication intercellulaire entre les hépatocytes et des cellules stromales est démontrée. La plate-forme développée permet d'enquête interactions cellule-cellule dans une variété de processus biologiques, y compris le développement et la pathogenèse.

Abstract

Le rôle du microenvironnement cellulaire est reconnu comme crucial dans la détermination du destin cellulaire et la fonction dans pratiquement tous les tissus des mammifères du développement à la transformation maligne. En particulier, l'interaction avec le stroma voisin a été impliqué dans une multitude de phénomènes biologiques, mais les techniques conventionnelles de limiter la capacité d'interroger les éléments spatiaux et dynamique de ces interactions.

En reconfigurables Culture micromécanique (RC), nous employons un substrat silicium micro-usiné avec des pièces mobiles pour contrôler dynamiquement interactions cellule-cellule par le biais de repositionnement mécanique. Auparavant, cette méthode a été appliquée pour étudier la communication intercellulaire dans les co-cultures d'hépatocytes et des cellules non parenchymateuses, démontrant les interactions dépendant du temps et une gamme limitée d'solubles de signalisation ^1.

Ici, nous décrivons en détail la préparation et l'utilisation du système de RC. Nous commençons par la démonstration de la manipulation des pièces périphériques utilisant une pince à épiler, y compris actionnement entre l'écart et les configurations de contact (les populations de cellules séparées par un étroit de 80 um écart, ou en contact direct intime). Ensuite, nous détaillons le processus de préparation des substrats pour la culture, et le processus multi-étapes d'ensemencement de cellules nécessaires pour l'obtention de monocouches de cellules confluentes. En utilisant la microscopie vivons, nous illustrons ensuite en temps réel la manipulation de cellules entre les différentes configurations possibles expérimental. Finalement, nous démontrons les étapes nécessaires afin de régénérer la surface du dispositif de réutilisation: le toluène et le nettoyage de piranha, le revêtement de polystyrène, et le traitement par plasma d'oxygène.

Protocol

Préparation des cultures cellulaires:

1. Commencez avec des pièces en silicium recouvert par du plasma traité polystyrène.
2. Manteau avec les parties appropriées des protéines de la matrice extracellulaire au support de fixation du type de cellule désiré. Pour les hépatocytes, incuber dans 50 g / ml de collagène une solution à 37 ° C pendant 45 min. Pour les fibroblastes 3T3, aucune matrice est nécessaire.
3. Verrouillage des pièces avec des rôles complémentaires dans la configuration de contact.
4. Faire tremper dans de l'éthanol à 70% pour un minimum de 10 minutes pour stériliser. Rincez 2x dans le trou DDH ₂ O, et 1x dans les milieux de culture cellulaire.
5. Cellules semences à une concentration de 500 000 cellules / ml dans le milieu de culture approprié. Utiliser 1 ml dans chaque puits d'une plaque de culture à 12 puits.
6. Incuber pendant 1 heure, en agitant toutes les 15 min pour remettre en suspension les cellules uniformément.
7. Si une monocouche confluente n'a pas été atteint après 1 h, aspirer la suspension cellulaire et l'ensemencement répéter avec une suspension fraîche. Répétez jusqu'à ce que la densité cellulaire désiré a été atteint.
8. Retirer les pièces complémentaires. Transfert des pièces aux puits frais et incuber une nuit pour permettre aux cellules de se conformer totalement et la propagation.
9. Formulaire de co-cultures par des pièces de verrouillage appropriés soit dans le fossé ou la configuration de contact. La configuration peut être modifiée à tout point désiré pendant la culture.
10. Lors du changement de support, prenez soin de laisser les piles sèches pour le temps aussi peu que possible, de préférence juste une seconde ou deux. Dessinez fluide avec une main et de remplacer immédiatement les médias utilisant l'autre main.

Pièces de silicium de traitement pour la réutilisation:

1. Bande de cellules en les trempant dans l'eau de Javel et de rinçage à l'eau.
2. Laisser les pièces à sécher complètement. Faire tremper dans du toluène pendant 2 h à bande de polystyrène.
3. Nettoyez en solution piranha (1:2 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ chauffé à 120 ° C.
4. Rincer pendant 15 min sous un flux continu de DDH ₂ O. Si vous n'allez pas déposer polystyrène immédiatement, stocker les pièces dans l'eau.
5. Dissoudre le polystyrène dans le toluène à 100 mg / ml. Vortex en polypropylène coniques pendant environ 1 heure ou jusqu'à dissolution complète. Un peu plus de 1 ml de solution est nécessaire pour chaque 10 parties.
6. Solution de polystyrène Spin manteau sur les pièces de silicium individuels à 2400 rpm pendant 30 sec.
7. Cuire au four pendant au moins 5 h à 120 ° C.
8. Traiter avec un plasma d'oxygène (200 mTorr, 200 W) pendant 1 min.

Discussion

Ce système est unique en ce qu'elle permet à l'organisation spatiale du tissu à manipuler dynamiquement au niveau cellulaire. Par conséquent, ce dispositif a permis à un certain nombre de nouvelles expériences biologiques, couvrant des sujets tels que la dynamique de signalisation intracellulaire, contactez-médiée par rapport signalant solubles, les décisions du destin cellulaire, la toxicologie, et la diaphonie cellulaire. Ce dispositif devrait être largement généralisables puisque le substrat de culture est en plastique standard de culture de tissus, et le système est compatible avec les méthodes standard de culture et d'essais. Par conséquent, nous pensons que cette plateforme sera d'intérêt général comme un outil pour l'étude de la cellule-cellule interaction entre plusieurs cellules et des tissus.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).