Los microchips de silicio para la Manipulación de la interacción célula-célula

Summary

Este artículo describe un método experimental para la regulación dinámica de las interacciones célula-célula entre células adherentes en una escala micrométrica. La manipulación de la comunicación intercelular entre los hepatocitos y células del estroma se demuestra. La plataforma desarrollada permite la investigación de las interacciones célula-célula en una variedad de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo y patogénesis.

Abstract

El papel del microambiente celular se reconoce como crucial para determinar el destino de células y la función en prácticamente todos los tejidos de los mamíferos del desarrollo a la transformación maligna. En particular, la interacción con estroma vecinos ha sido implicado en una gran cantidad de fenómenos biológicos, sin embargo, las técnicas convencionales de limitar la capacidad de interrogar a los elementos espaciales y la dinámica de estas interacciones.

En micromecánico Cultura Reconfigurable (RC), contamos con un sustrato de silicio micromecanizados con las piezas móviles para controlar dinámicamente interacciones célula-célula a través de mecánicas de reposicionamiento. Anteriormente, este método ha sido aplicado para investigar la comunicación intercelular en co-cultivos de hepatocitos y las células no parenquimatosas, lo que demuestra que dependen del tiempo y la interacción de una gama limitada de solubles de señalización ^1.

A continuación, describimos en detalle la preparación y el uso del sistema de RC. Comenzamos demostrando el manejo de las piezas del dispositivo con unas pinzas, incluyendo accionamiento entre la brecha y configuraciones de contactos (las poblaciones de células separadas por un estrecho de 80 micras brecha, o en contacto íntimo directo). A continuación, detallamos el proceso de preparación de los sustratos para el cultivo y el proceso de siembra de varios pasos necesarios para la obtención de células monocapas confluentes de células. Mediante microscopía de vivir, entonces ilustrar manipulación en tiempo real de las células entre las diferentes configuraciones posibles experimental. Por último, demostrar los pasos necesarios con el fin de regenerar la superficie del dispositivo para su reutilización: tolueno y la limpieza de pirañas, revestimiento de poliestireno, y el tratamiento con plasma de oxígeno.

Protocol

Preparación de cultivos celulares:

1. Comience con las piezas de silicio recubierto con plasma tratados con poliestireno.
2. Con las correspondientes piezas de abrigo proteínas de matriz extracelular de soporte para archivos adjuntos de tipo celular deseado. De los hepatocitos, se incuban en 50 g / ml de colágeno-1 solución a 37 ° C durante 45 min. Para los fibroblastos 3T3, ninguna matriz que se necesita.
3. Bloqueo de piezas con partes que se complementan en la configuración de contacto.
4. Sumerja en etanol al 70% por un mínimo de 10 minutos para esterilizar. Enjuague 2x en _ddH2O, y 1x en medios de cultivo celular.
5. Las células de las semillas a una concentración de 500.000 células / ml en el medio de cultivo apropiado. Use 1 ml en cada pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos.
6. Incubar durante 1 hora, moviendo cada 15 minutos para volver a suspender las células por igual.
7. Si una monocapa no se ha logrado después de 1 hora, aspirar la suspensión celular y la siembra de repetir con una suspensión fresca. Repita hasta que la densidad celular deseada se ha logrado.
8. Quitar las partes complementarias. Traslado de una parte a los pozos nuevos y se incuba durante la noche para permitir que las células se adhieran y se extendió por completo.
9. Forma co-cultivos mediante el bloqueo de alguna de sus partes ya sea en la distancia o la configuración de contactos. La configuración se puede cambiar en cualquier momento que desee durante el cultivo.
10. Al cambiar los medios de comunicación, tenga cuidado de dejar las pilas secas para el menor tiempo posible, de preferencia un segundo o dos. Extraer el líquido con una mano y reemplazar de inmediato los medios de comunicación con la otra mano.

Procesamiento de piezas de silicio para su reutilización:

1. Franja de células en remojo en lejía y aclarar con agua.
2. Permita que las piezas se sequen por completo. Remoje en tolueno durante 2 horas a la tira de poliestireno.
3. Limpia en una solución de pirañas (01:02 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ se calienta a 120 ° C.
4. Enjuague por 15 minutos con un flujo continuo de ddH ₂ O. Si no se va a depositar poliestireno inmediatamente, almacenar las piezas en agua.
5. Disolver poliestireno en tolueno a 100 mg / ml. Vórtice de polipropileno cónico durante aproximadamente 1 hora o hasta que esté completamente disuelta. Un poco más de 1 ml de solución se requiere por cada 10 partes.
6. Capa de poliestireno giro solución en las partes individuales de silicio a 2.400 rpm durante 30 segundos.
7. Hornee durante al menos 5 horas a 120 ° C.
8. Tratar con plasma de oxígeno (200 mTorr, 200 W) durante 1 min.

Discussion

Este sistema es único, ya que permite a la organización espacial de los tejidos manipulados de forma dinámica a nivel celular. En consecuencia, este dispositivo ha permitido una serie de nuevos experimentos biológicos, que abarcan temas tales como la señalización intercelular dinámica, con la mediación de contacto frente a la señalización soluble, las decisiones de la celda destino, la toxicología y la interferencia celular. Este dispositivo debe ser ampliamente generalizados ya que el sustrato de cultivo es de plástico estándar de cultivo de tejidos, y el sistema es compatible con los métodos estándar de cultivo y ensayos. Por lo tanto, creemos que esta plataforma será de gran interés como herramienta para el estudio de la célula-célula la interacción entre muchas células y tejidos.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).