Microchips de silício para Manipulação de célula-Interação

Summary

Este artigo descreve uma abordagem experimental para a regulação dinâmica de interações célula-célula entre células aderentes em escala micrométrica. Manipulação da comunicação intercelular entre hepatócitos e células do estroma é demonstrada. A plataforma desenvolvida permite a investigação de interações célula-célula em uma variedade de processos biológicos, incluindo o desenvolvimento e patogênese.

Abstract

O papel do microambiente celular é reconhecida como crucial para determinar o destino da célula e função em praticamente todos os tecidos de mamíferos de desenvolvimento para transformação maligna. Em particular, a interação com estroma vizinho tem sido implicado em uma infinidade de fenômenos biológicos, no entanto, as técnicas convencionais limitar a capacidade de interrogar os elementos espaciais e dinâmica de tais interações.

Em Cultura Reconfigurável micromecânico (RC), que empregam um substrato de silício microusinados com partes móveis para controlar dinamicamente interações célula-célula através de reposicionamento mecânica. Anteriormente, este método tem sido aplicado para investigar comunicação intercelular em co-culturas de hepatócitos e células não-parenquimatosas, demonstrando interações dependentes do tempo e uma gama limitada de sinalização solúvel ^1.

Aqui, descrevemos em detalhes a preparação e utilização do sistema RC. Começamos por demonstrar a movimentação das partes do dispositivo usando uma pinça, inclusive atuando entre a abertura e configurações de contacto (populações de células separadas por um intervalo de 80 mM estreito, ou em contato íntimo direta). Em seguida, detalhamos o processo de preparação dos substratos para a cultura, eo multi-etapa do processo de semeadura de células necessárias para a obtenção de monocamadas de células confluentes. Usando a microscopia ao vivo, nós então ilustrar tempo real manipulação de células entre as diferentes possíveis configurações experimentais. Finalmente, demonstrar os passos necessários, a fim de regenerar a superfície do dispositivo para reutilização: tolueno e limpeza piranha, revestimento de isopor, e tratamento de plasma de oxigênio.

Protocol

Preparação de culturas de células:

1. Comece com peças de silício revestido com plasma tratado com poliestireno.
2. Revestimento com peças apropriadas proteínas da matriz extracelular para suporte de fixação do tipo de célula desejada. Para hepatócitos, incubar em 50 g / ml Colágeno-1 solução a 37 ° C por 45 min. Para fibroblastos 3T3, nenhuma matriz é necessário.
3. Bloqueio peças com partes complementares na configuração de contato.
4. Mergulhe em álcool 70% para um mínimo de 10 min para esterilizar. Lave 2x em DDH ₂ O, e 1x em meios de cultura celular.
5. Células de semente em uma concentração de 500.000 células / ml no meio de cultura apropriado. Use 1 ml em cada poço de uma placa de cultura de 12 também.
6. Incubar por 1 hora, agitando a cada 15 minutos para voltar a suspender as células uniformemente.
7. Se uma monocamada confluente não foi alcançado após 1 hr, aspirar a suspensão celular e semeadura repetir com uma suspensão nova. Repita até que a densidade de célula desejada foi alcançada.
8. Remova as peças complementares. Transferência de peças a fresco poços e incubar durante a noite para permitir que as células aderem e se espalhou completamente.
9. Forma co-culturas, bloqueando partes apropriadas em qualquer lacuna ou configuração de contato. A configuração pode ser alterado em qualquer ponto desejado durante a cultura.
10. Ao mudar de mídia, ter o cuidado de deixar pilhas secas para o tempo mínimo possível, de preferência apenas um segundo ou dois. Extrair fluido com uma mão e substituir imediatamente mídia usando a outra mão.

Peças de silício de processamento para reutilização:

1. Faixa de células por imersão em água sanitária e enxaguar com água.
2. Permitem que as peças secar completamente. Mergulhe em tolueno por 2 h para tira de poliestireno.
3. Limpa em solução piranha (1:02 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ aquecido a 120 ° C.
4. Enxágüe por 15 minutos sob um fluxo contínuo de DDH ₂ O. Se você não está indo para depósito de poliestireno imediatamente, guarde as peças em água.
5. Dissolver poliestireno em tolueno a 100 mg / ml. Vortex em polipropileno cônica por cerca de 1 hora, ou até completamente dissolvido. Um pouco mais de 1 ml de solução é necessária para cada 10 partes.
6. Spin-solução de poliestireno casaco peças de silício individuais em 2400 rpm por 30 seg.
7. Leve ao forno por pelo menos 5 horas a 120 ° C.
8. Tratar com plasma de oxigênio (200 mTorr, 200 W) durante 1 min.

Discussion

Este sistema é o único que permite que a organização espacial do tecido a ser manipulada de forma dinâmica a nível celular. Conseqüentemente, este dispositivo permitiu uma série de novas experiências biológicas, abrangendo temas como a dinâmica de sinalização intercelular, entre em contato mediada contra sinalização solúveis, as decisões destino celular, toxicologia e crosstalk celular. Este dispositivo deve ser amplamente generalizável desde o substrato plástico a cultura é a cultura padrão do tecido, eo sistema é compatível com métodos de cultura padrão e ensaios. Por isso, acreditamos que esta plataforma será de grande interesse como uma ferramenta para o estudo de célula-interação entre diferentes células e tecidos.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).