Silicon mikrochips för Manipulera cell-cell interaktion

Summary

Den här artikeln beskriver en experimentell metod för dynamisk reglering av cell-cell interaktioner mellan anhängare celler på en mikrometer skala. Manipulering av intercellulära kommunikationen mellan hepatocyter och stromaceller cellen visas. Den utvecklade plattformen möjliggör undersökning av cell-cell interaktioner i olika biologiska processer, inklusive utveckling och patogenes.

Abstract

Roll cellulära mikromiljön redovisas som avgörande för cellens öde och funktion i stort sett alla däggdjursvävnader från utveckling till maligna omvandling. Framför allt har samverkan med angränsande stroma varit inblandad i en uppsjö av biologiska fenomen, men konventionella tekniker begränsa möjligheten att förhöra den rumsliga och dynamiska inslag av sådana interaktioner.

I Mikromekaniska Rekonfigurerbara Kultur (RC), använder vi en micromachined kiselsubstrat med rörliga delar för att dynamiskt styra cell-cell interaktioner genom mekanisk ompositionering. Tidigare har denna metod använts för att undersöka kommunikationen mellan i samarbete kulturer av hepatocyter och icke-parenkymceller, vilket visar tidsberoende interaktion och ett begränsat sortiment för lösligt signalering ^1.

Här beskriver vi i detalj beredning och användning av RC-systemet. Vi börjar med att visa att hanteringen av enheten delar med pincett, inklusive aktivering mellan gapet och konfigurationer kontakt (cellpopulationer åtskilda av en smal 80-ìm lucka, eller i direkt intim kontakt). Sedan vi detalj förberedelsen av substrat för kulturen, och den i flera steg cell seedning process som krävs för att erhålla confluent cell monolager. Använda bor mikroskopi, illustrerar vi sedan i realtid manipulering av celler mellan de olika möjliga experimentella konfigurationer. Slutligen visar vi de åtgärder som krävs för att regenerera enheten ytan för återanvändning: toluen och Piranha rengöring, polystyren beläggning, och syre plasma behandling.

Protocol

Beredning av cellkulturer:

1. Börja med silikon delar belagda med plasma-behandlade polystyren.
2. Coat delar med lämpliga extracellulära matrix proteiner för att stödja fastsättning av önskad celltyp. För hepatocyter, inkubera i 50 g / ml Kollagen-1-lösning vid 37 ° C i 45 min. För 3T3 fibroblaster, ingen matris behövs.
3. Lås delar med kompletterande delar i kontakt konfiguration.
4. Blötlägg i 70% etanol i minst 10 min för att sterilisera. Skölj 2x i DDH ₂ O, och 1x i media cellkultur.
5. Seed cellerna vid en koncentration på 500.000 celler / ml i lämpligt odlingsmedium. Använd 1 ml i varje brunn på en 12-bra kultur plattan.
6. Inkubera i 1 timme, skaka var 15 min till återsuspendera celler jämnt.
7. Om ett sammanflytande monolager inte har uppnåtts efter 1 timme, aspirera cellsuspension och upprepa sådd med en ny fjädring. Upprepa tills önskad celltätheten har uppnåtts.
8. Ta bort de kompletterande delarna. Överföra delar ut i friska brunnar och inkubera över natten så att cellerna att följa och sprida helt.
9. Form co-kulturer genom att låsa lämpliga delar till antingen gapet eller kontakta konfiguration. Konfigurationen kan ändras när som helst önskad punkt under kultur.
10. När du byter media, vara noga med att lämna celler torka under så kort tid som möjligt, helst bara en sekund eller två. Dra ut vätskan med en hand och omedelbart ersätta media med den andra handen.

Behandling kisel delar för återanvändning:

1. Strip celler genom blötläggning i blekmedel och skölj med vatten.
2. Låt delarna torka helt. Blötlägg i toluen under 2 h att strippa polystyren.
3. Rengör i piraya lösning (01:02 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ uppvärmd till 120 ° C.
4. Skölj i 15 min under ett kontinuerligt flöde av DDH ₂ O. Om du inte ska sätta in polystyren omedelbart, förvara delarna i vatten.
5. Lös polystyren i toluen vid 100 mg / ml. Vortex i polypropylen konisk i ca 1 timme, eller tills helt upplöst. Lite mer än 1 ml lösning krävs för varje 10 delar.
6. Spin päls polystyren lösning på enskilda kisel delar vid 2400 rpm i 30 sek.
7. Grädda i minst 5 timmar vid 120 ° C.
8. Behandla med syre plasma (200 mTorr, 200 W) i 1 min.

Discussion

Detta system är unikt genom att det möjliggör den rumsliga organisationen av vävnad att vara dynamiskt manipuleras på cellnivå. Därför har denna enhet möjligt för ett antal nya biologiska experiment, som spänner över ämnen som intercellulära signaler dynamik, kontakt-medierad kontra lösliga signalering, cell beslut ödet, toxikologi, och cellulära överhörning. Denna enhet bör ges stor generaliserbara eftersom kulturen substratet är standard vävnadsodling plast, och systemet är kompatibelt med standard kultur metoder och analyser. Därför tror vi att denna plattform kommer att vara av stort intresse som ett verktyg för att studera cell-cell interaktionen mellan många olika celler och vävnader.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).