Silizium-Mikrochips zur Manipulation Zell-Zell-Interaktion

Summary

Dieser Artikel beschreibt einen experimentellen Ansatz zur dynamischen Regulation der Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen adhärenten Zellen im Mikrometerbereich. Manipulation der interzellulären Kommunikation zwischen Hepatozyten und Stromazellen nachgewiesen ist. Die entwickelte Plattform ermöglicht Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich der Entwicklung und Pathogenese.

Abstract

Die Rolle der zellulären Mikroumgebung ist entscheidend bei der Bestimmung Zellschicksals und Funktion in nahezu allen Säugetiergewebe von der Entwicklung zur malignen Transformation anerkannt. Insbesondere hat die Interaktion mit benachbarten Stroma in einer Vielzahl von biologischen Phänomenen in Verbindung gebracht, jedoch begrenzen konventionellen Techniken die Möglichkeit, die räumlichen und dynamischen Elementen solcher Wechselwirkungen zu verhören.

In Mikromechanische Reconfigurable Kultur (RC), beschäftigen wir eine mikromechanische Silizium-Substrat mit beweglichen Teilen zur dynamischen Steuerung von Zell-Zell-Interaktionen durch mechanische Neupositionierung. Bisher wurde diese Methode angewendet, um interzelluläre Kommunikation in Co-Kulturen von Hepatozyten und Nicht-Parenchym-Zellen zu untersuchen, zeigen zeitabhängige Wechselwirkungen und eine begrenzte Reichweite für lösliche Signalisierung ^1.

Hier beschreiben wir im Detail die Herstellung und Verwendung der RC-System. Wir beginnen mit der Demonstration der Handhabung des Gerätes Teile mit einer Pinzette, einschließlich Betätigung zwischen dem Spalt und Kontakt-Konfigurationen (Zellpopulationen durch einen schmalen 80-um Spalt getrennt, oder in direkten engen Kontakt). Als nächstes haben wir ausführlich den Prozess der Vorbereitung der Substrate für die Kultur und die multi-step Zellaussaat Verfahren zur Gewinnung von konfluenten Zellrasen erforderlich. Mit Live-Mikroskopie, wir dann zeigen, Echtzeit-Manipulation von Zellen zwischen den verschiedenen möglichen experimentellen Konfigurationen. Schließlich zeigen wir die Schritte, die erforderlich sind, um die Oberfläche der Vorrichtung für die Wiederverwendung zu regenerieren: Toluol und Piranha Reinigung, Polystyrol-Beschichtung und Sauerstoff-Plasma-Behandlung.

Protocol

Vorbereitung von Zellkulturen:

1. Beginnen Sie mit Silizium-Teile mit Plasma behandelte Polystyrol beschichtet.
2. Coat Teile mit entsprechenden Proteine ​​der extrazellulären Matrix zu unterstützen Befestigung der gewünschten Zelltyp. Für Hepatozyten, in 50 g / ml Collagen-1-Lösung bei 37 ° C für 45 min inkubieren. Für 3T3-Fibroblasten, ist keine Matrix benötigt.
3. Lock-Teile mit ergänzenden Teilen in Berührung Konfiguration.
4. Tauchen Sie ein in 70% Ethanol für mindestens 10 min zu sterilisieren. Spülen Sie 2x in ddH ₂ O, und 1x in Zellkulturmedien.
5. Seed-Zellen bei einer Konzentration von 500.000 Zellen / ml in dem entsprechenden Kulturmedium. Verwenden Sie 1 ml in jede Vertiefung einer 12-well-Kulturplatte.
6. Inkubation für 1 h Schütteln alle 15 min wieder auszusetzen Zellen gleichmäßig.
7. Wenn ein Monolayer nicht nach 1 Std. erreicht worden, saugen die Zellsuspension und wiederholen Impfen mit einer frischen Suspension. Wiederholen, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist.
8. Entfernen Sie die komplementären Teile. Transfer-Teile an die frische Brunnen beimpft und über Nacht, damit Zellen zu halten und zu verbreiten voll.
9. Form Co-Kulturen durch Sperren entsprechenden Teile entweder in die Lücke, oder wenden Sie Konfiguration. Die Konfiguration kann an jeder beliebigen Stelle während der Kultur geändert werden.
10. Beim Wechsel Medien kümmern zu verlassen Zellen trocknen so wenig Zeit wie möglich, vorzugsweise nur ein oder zwei Sekunden. Draw aus Flüssigkeit mit einer Hand und sofort zu ersetzen, Medien mit der anderen Hand.

Verarbeitung von Silizium Teile zur Wiederverwendung:

1. Streifen-Zellen durch Einweichen in Bleich-und Spülen mit Wasser.
2. Lassen Teile vollständig trocknen. Tauchen Sie ein in Toluol 2 h auf Polystyrol Streifen.
3. Clean in Piranha-Lösung (1:2 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ auf 120 ° C.
4. Spülen für 15 min unter einem kontinuierlichen Fluss von ddH ₂ O. Wenn Sie nicht vorhaben, Polystyrol sofort einzahlen, speichern Sie die Teile in Wasser.
5. Lösen Polystyrol in Toluol bei 100 mg / ml. Vortex in Polypropylen konisch für ca. 1 Std., oder bis es vollständig gelöst. Ein wenig mehr als 1 ml der Lösung ist für alle 10 Teile erforderlich.
6. Spin Mantel Polystyrol-Lösung auf einzelne Silizium-Teile bei 2.400 rpm für 30 sec.
7. Backen Sie für mindestens 5 h bei 120 ° C.
8. Behandeln Sie mit Sauerstoffplasma (200 mTorr, 200 W) für 1 min.

Discussion

Dieses System ist einzigartig, da es die räumliche Organisation von Gewebe, um dynamisch auf der zellulären Ebene manipuliert werden können. Folglich hat dieses Gerät eine Reihe von neuartigen biologischen Experimente aktiviert, Spanning Themen wie interzellulären Signalübertragung Dynamik, wenden Sie vermittelte im Vergleich zu löslichem Signalisierung, Zellschicksal Entscheidungen, Toxikologie und zelluläre Übersprechen. Dieses Gerät sollte weitgehend verallgemeinerbar, da die Kultur Substrat Standard Gewebekultur Kunststoff, und das System ist kompatibel mit Standard-Kultur Methoden und Tests. Daher glauben wir, dass diese Plattform wird von breitem Interesse als Werkzeug zur Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen zwischen vielen verschiedenen Zellen und Geweben werden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).