Summary
Программируемая гибель клеток анализы обычно используется в млекопитающих, таких как laddering ДНК или TUNEL анализы, часто сложно воспроизвести в растениях. В сочетании с системой репортером GUS, мы предлагаем быстрое, на основе растений переходных анализа для анализа потенциальных свойств смерти конкретных генов.
Abstract
Мы разработали новые переходные системы экспрессии растения, которое одновременно выражает ген-репортер, β-глюкуронидазы (GUS), с предполагаемым положительным или отрицательным регуляторы клеточной смерти. В этой системе, Н. benthamiana листья совместно проникли с 35S приводом кассету выражения, содержащего ген, которые будут проанализированы, и GUS вектор pCAMBIA 2301 использованием Agrobacterium штамм LBA4404 как транспортное средство. Потому что живые клетки, необходимые для GUS экспрессия происходит, снижение активности GUS, как ожидается, когда этот маркерный ген является одним из выражены с положительным регуляторы клеточной смерти. Равным образом, увеличилась GUS активность наблюдается при антиапоптотического гены используются по сравнению с переносчиками болезней. Как будет показано ниже, мы успешно использовали эту систему в нашей лаборатории для анализа и про-и анти-смерть игроков. Они включают завод антиапоптотического Bcl-2 Связанные athanoGene (BAG) семьи, а также, известный млекопитающих индукторов гибели клеток, таких как BAX. Кроме того, мы использовали эту систему для анализа смерти функции специфических усечения в белках, которые могли бы пролить свет на возможный пост-трансляционной модификации / активации этих белков. Здесь мы представляем быстрый и чувствительный метод, основанный на заводе, в качестве первого шага в расследовании смерти функции специфических генов.
Protocol
Nicotiana benthamiana растения выращивают в контролируемой температурой ростовой камере при температуре 25 ° C. Полностью расширена здоровые листья из 3-6 недельных растения используются.
Совет: Лучшие результаты достигаются при использовании вновь возникающих листьев
1. Agrobacterium переходных протокол инфильтрация:
День 1
- Л. Б. подряд / Рифампицин (25 мкг / мл) / канамицину (100 мкг / мл) агаром с глицерином запасы Agrobacterium tumefaciens (штамм LBA4404), содержащий соответствующие векторы с ген (ы) должны быть исследованы на гибель клеток и вектор, содержащий Кассета GUS под конститутивного промотора. Всегда включайте пустую векторное управление в качестве отрицательного контроля.
- Инкубировать при 28 ° С в течение 2 дней.
День 3
- Привить 2 мл LB содержащих рифампицин (25 мкг / мл) и канамицину (100 мкг / мл) с одной колонии из каждого LB / Рифампицин / Канамицин пластины ранее прожилками.
- Инкубируйте каждую культуру, встряхивая при 28 ° С в течение 24 часов при 200 оборотов в минуту до максимальной плотности рост будет достигнут.
Совет: Clumping иногда наблюдается, в этом случае культур должны быть тщательно ресуспендировали (т.е. пипетирования вверх и вниз) перед началом работы.
День 4
- После инкубации, увеличить общий объем до 10 мл свежей LB (содержащий соответствующие антибиотики) и acetosyringone (конечная концентрация 25 мкМ).
- Инкубируйте каждую культуру, встряхивая при 28 ° С в течение еще 16 часов.
День 5
- На следующий день мыть каждую культуру в два раза, добавляя 10 мл (не добавляйте acetosyringone) инфильтрация среду (10 мМ MgSO 4 .7 H 2 O, 9 мМ MES, рН 5,6) и центрифуге при 4000 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
- После последнего шага центрифугирования, ресуспендируют каждой культуры в 5 мл среды, содержащей инфильтрации acetosyringone (100 мкМ).
- Измерить диаметр 600 нм, измерения от 0,1 до 0,9, являются приемлемыми.
Совет: OD 600 нм от столь же низко как 0,1 были использованы без проблем, однако, выше ОР может привести к более устойчивые результаты. - Инкубируйте культур в течение 3 часов, чтобы подготовить Agrobacterium культур для инфекции.
- Смешайте культур, содержащих ген (ы) должны быть проанализированы и отрицательного контроля (Agrobacterium содержащих пустой вектор) в соотношении 1:1 с культурой содержащие кассеты GUS.
- Проникнуть абаксиальный (под) сторона вновь возникающих листьев использованием 1 мл без иглы шприца (рис. 1).
Совет: Проникнуть как отрицательные смеси управления (пустой вектор + кассета GUS) и смесь, содержащую ген быть проанализированы (ген GUS х + кассета) на противоположных листьев того же растения. Использование трех экземплярах растения для каждой процедуры. - 3-х дней после проникновения акцизного проникли листья и тест для экспрессии белка GUS.
2. Гистохимические анализа GUS
День 8
- Вакуумные проникнуть X-Gluc подложки среды в вырезали листьев.
- Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение ночи или до синего окрашивания различных появляется.
День 9
- Промыть в дистиллированной воде.
- Инкубируйте в 70% этанола до хлорофилла удаляется, затем трансфер в дистиллированную воду. Визуально оценить уровни GUS выражения.
3. Флуорометрические анализа MUG:
День 8
- Изолировать общего белка путем измельчения проникли дисков листьев в ступке с помощью жидкого азота. Добавить 100 мкл буфера GUS добыча (50 мМ Напи рН 7,0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Тритон Х-100, 0,1% N-lauroylsarcosine натриевой соли, β-меркаптоэтанол (0,7 мкл / мл), сохраняя при этом образцы на льду.
- Центрифуга подвески при 14000 г в течение 5 мин при 4 ° С и принимать супернатант как общее растворимого белка.
- Мера концентрации, пользуясь nanodrop в соответствии с инструкциями производителя.
- Отрегулируйте концентрации белка до 100 мкг от общего растворимого белка для каждого образца с помощью GUS буфера для экстракции.
- Добавить MUG подложке (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида тригидрат), подготовленный в буфер извлечения GUS в конечной концентрации 2 мМ. Общий объем 100 мкл каждой пробы (белок + MUG подложки) должно быть достаточно.
- Инкубируйте реакции в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
- Остановить реакцию добавлением 800 мкл стоп GUS буфере (0,2 М Na 2 CO 3).
- Мера флуоресценции с помощью ридер на длине волны возбуждения 365 нм и длине волны излучения 455 нм и сравнить значения MU стандартной кривой. Доклад уровни активности GUS как нмоль MU / мкг общего растворимого белка / мин.
4. Акции и решения:
- Acetosyringone (1 М), акции (FW = 196,2 г)
- Канамицину (100 мг / мл), акции - подготовить в дН 2 0 - фильтр стерилизовать
- Рифампицин (25 мг / мл), акции - подготовить в ДМСО
- Лурия-Бертани (LB) жидких питательных сред: (1L)
1% (м / о) Бакто-триптон, 10 г
0,5% (м / о) Бакто-дрожжевого экстракта, 5 г
170 мМ хлорида натрия 10 г
рН - 7 - Acetosyringone (25 мкМ) = 25 мкл 1 М складе в конечном объеме 1 мл
- Проникновение Medium: (1L)
10 мМ MgSO 4 0,7 дН 2 0 (FW = 246,48 г), 2,4648 г
9 мМ MES (FW = 213,25 г), 1,91925 г
рН - 5,6 - Acetosyringone (100 мкМ) = 100 мкл 1М складе в конечном объеме 1 мл
- GUS буфера для экстракции
50 мМ Напи рН 7,0, 10 мМ ЭДТА, 0,1% Тритон Х-100, 0,1% N-lauroylsarcosine натриевой соли, β-меркаптоэтанол (0,7 мкл / мл) - 2x Фосфатный буфер
0,2 М NaH 2 PO 4 и 0,2 М Na 2 HPO 4 рН 7 - X-Gluc раствора субстрата
Растворите 1 мг 5-бром-4-хлор-3-индолил BD-глюкуронида (X-Gluc) в 0,1 мл метанола. Добавить 1 мл 2 раза фосфатного буфера, 20 мкл 0,1 М калий феррицианида, 10 мкл тритона Х-100 10% и 850 мкл дистиллированной воды.
5. Представитель результаты:
После этого протокола, потеря выражение GUS, как ожидается, когда гибель клеток происходит. Мы одновременно выразил ген-репортер, β-глюкуронидазы (GUS) с одним из членов цито-защитной Arabidopsis Bcl-2 Связанные athanoGene (BAG) семьи. Мы сотрудничаем проникли Н. benthamiana листья с 35S приводом кассеты выражение BAG и GUS вектор pCAMBIA 2301 использованием Agrobacterium штамм LBA4404. Как показано на рисунке 2, видимое увеличение окрашивания GUS наблюдалось после этого проникновения. И наоборот, когда известный проапоптическую член Bcl-2 семейство BAX был использован, выраженное снижение окрашивания GUS не наблюдалось (рис. 2). В обоих этих случаях, GUS экспрессия визуально отличаются по сравнению с контролем. Однако, когда разница в выражении менее очевидно, флуорометрические анализов MUG могут быть выполнены, чтобы quanitate GUS выражения.
Рисунок 1. Пример Agrobacterium смесь инфильтрации абаксиальный стороны Н. benthamiana листьев использованием 1 мл без иглы шприца.
Рисунок 2. Вектор GUS была совместно выражается в Н. benthamiana листья против смертной ген, и известный индуктор гибели клеток. GUS уровни по сравнению с пустыми векторное управление (ГСУ контроля).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | VWR international | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4’-hydroxy-3’,5’-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR international | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR international | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR international | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR international | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR international | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR international | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR international | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR international | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma-Aldrich | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR international | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone(MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR international | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
