Summary
موت الخلايا المبرمج المقايسات التي يشيع استخدامها في نظم الثدييات مثل الحمض النووي أو المقايسات laddering النفق ، وغالبا ما يصعب استنساخها في النباتات. في توليفة مع نظام مراسل GUS ، نقترح السريع ، ومحطة عابرة مقايسة يستند إلى تحليل خصائص الموت المحتملة للجينات معينة.
Abstract
وقد طورنا رواية التعبير محطة عابرة في وقت واحد يعبر عن نظام الجين المراسل ، β غلوكورونيداز (GUS) ، مع المنظمين المفترضين الإيجابية أو السلبية لموت الخلية. في هذا النظام ، N. ويترك benthamiana المشترك تسللت مع الكاسيت التي تحتوي على التعبير مدفوعة 35S الجين لتحليلها ، وناقلات GUS pCAMBIA 2301 باستخدام الأجرعية LBA4404 سلالة كوسيلة. لأن هناك حاجة الخلايا الحية للتعبير GUS تحدث ، ومن المتوقع فقدان النشاط GUS عند هذا الجين علامة المشترك مع المنظمين وأعرب الإيجابية للموت الخلية. على قدم المساواة ، وزيادة النشاط GUS لوحظ عند استخدام الجينات المضادة للأفكارك مقارنة مكافحة النواقل. كما هو مبين أدناه ، وقد استخدمنا هذا النظام بنجاح في المختبر لتحليل كل من اللاعبين المؤيدة والمناهضة للموت. وتشمل هذه المحطة لمكافحة أفكارك بي سي إل 2 المرتبطين athanoGene (BAG) عائلة ، فضلا عن المعروف محرضات الثدييات من موت الخلايا ، مثل BAX. بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا هذا النظام لتحليل وظيفة فاة truncations محددة داخل البروتينات ، التي يمكن أن تقدم أدلة على تعديل محتمل في مرحلة ما بعد متعدية / تفعيل هذه البروتينات. هنا ، نقدم طريقة سريعة والنباتات الحساسة القائمة ، كخطوة أولية في التحقيق في وفاة وظيفة للجينات معينة.
Protocol
وتزرع نباتات نيكوتيانا benthamiana في غرفة التحكم في درجة حرارته النمو عند 25 درجة مئوية. وتستعمل أوراق صحية موسعة تماما من النباتات القديمة 3-6 الاسبوع.
نصيحة : يمكن الحصول على أفضل النتائج باستخدام أوراق الناشئة حديثا
1. الأجرعية بروتوكول تسلل عابرة :
اليوم 1
- لوحات متتالية آغار LB / ريفامبيسين (25 ميكروغرام / مل) / الكانامايسين (100 ميكروغرام / مل) مع مخزون من الجلسرين المورمة الأجرعية (سلالة LBA4404) التي تحتوي على النواقل المناسبة مع الجينات (ق) إلى أن يعاير لموت الخلايا ، والتي تحتوي على النواقل الكاسيت GUS تحت المروج التأسيسية. وتشمل دائما مكافحة ناقلات فارغة كعنصر تحكم سلبية.
- احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
اليوم 3
- تطعيم 2 مل من LB تحتوي ريفامبيسين (25 ميكروغرام / مل) ، والكانامايسين (100 ميكروغرام / مل) مع مستعمرة واحدة من كل رطل / ريفامبيسين / الكاناميسين وحة يشوبه سابقا.
- احتضان كل ثقافة عن طريق هز عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بسرعة 200 دورة في الدقيقة حتى يتم الوصول إلى أقصى كثافة النمو.
ويلاحظ أحيانا التثاقل ، في حال الثقافات التي تحتاج إلى أن يكون معلق تماما (أي pipetting صعودا وهبوطا) قبل المتابعة : تلميح.
اليوم 4
- التالية الحضانة ، وزيادة الحجم الإجمالي إلى 10 مل مع LB الطازجة (التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة) وacetosyringone (نهائي تركيز 25 ميكرومتر).
- احتضان كل ثقافة عن طريق هز عند 28 درجة مئوية لمدة ساعة 16.
5 أيام
- في اليوم التالي يغسل كل ثقافة مرتين عن طريق إضافة 10 مل (لا تضيف acetosyringone) متوسطة التسلل (10 ملي MgSO 4 0.7 H 2 O ، MES 9 ملم ، ودرجة الحموضة 5.6) وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد خطوة الطرد النهائي ، resuspend كل ثقافة في المتوسط 5 مل تحتوي على تسلل acetosyringone (100 ميكرومتر).
- قياس ل 600Nm OD ، وقياسات بين 0.1 و 0.9 مقبولة.
نصيحة : قد استخدمت من OD ل 600Nm منخفضة مثل 0.1 دون مشكلة ، ومع ذلك ، قد تنتج المواد المستنفدة للأوزون أعلى نتائج أكثر اتساقا. - احتضان الثقافات لمزيد من 3 ساعات للتحضير للثقافات الأجرعية للعدوى.
- خليط الثقافات التي تحتوي على الجين (ق) ليتم تحليلها ومراقبة سلبية (الأجرعية تحتوي على ناقلات الفارغة) في نسبة 1:1 مع ثقافة الكاسيت التي تحتوي على GUS.
- اختراق مجافي المحور (تحت) بجانب يترك الناشئة حديثا باستخدام 1 مل إبرة حقنة أقل (الشكل 1).
نصيحة : إخترق كل من خليط السيطرة السلبية (ناقلات فارغة + GUS الكاسيت) والتي تحتوي على خليط من الجينات أن يعاير (الجينات X GUS كاسيت +) على أوراق الآخر من نفس النبات. استخدام النباتات ثلاث نسخ عن كل معاملة. - تسلل 3 أيام بعد تسلل المكوس أوراق ومقايسة للتعبير البروتين GUS.
2. مقايسة النسيجية GUS
اليوم 8
- فراغ اختراق المتوسطة ركيزة X - الغلوكوز في أوراق استئصاله.
- احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها أو حتى تلوين الزرقاء مميزة تظهر.
اليوم 9
- شطف في المياه المقطرة.
- احتضان في الايثانول 70 ٪ حتى تتم إزالة الكلوروفيل ، ثم نقل إلى الماء المقطر مرة أخرى. تقييم مستويات التعبير بصريا GUS.
3. Fluorometric MUG مقايسة :
اليوم 8
- عزل بروتين مجموع طحن أقراص أوراق تسللت في بمدافع الهاون باستخدام النيتروجين السائل. إضافة 100 UL العازلة من استخراج GUS (50 ملي NaPi الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 10 ملي EDTA ، 0.1 ٪ تريتون X - 100 ، 0.1 ٪ N - lauroylsarcosine ملح الصوديوم ، β - المركابتويثانول (0.7 ميكروليتر / مل) مع الحفاظ على عينة على الجليد.
- تعليق العمل في أجهزة الطرد المركزي 14000 ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 واتخاذ طاف والبروتين الذائبة.
- قياس تركيز باستخدام nanodrop وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- ضبط تركيز البروتين إلى 100 ميكروغرام من البروتين الذائبة لكل عينة باستخدام GUS العازلة الاستخراج.
- إضافة الركيزة MUG (4 - methylumbelliferyl - β - D - غلوكورونيد هيدرات) التي أعدت في استخراج العازلة GUS إلى تركيز النهائي من 2 ملم. وينبغي أن يكون الحجم الإجمالي من 100 ميكرولتر لكل عينة (بروتين + الركيزة MUG) قد يكون كافيا.
- ردود الفعل لاحتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- وقف ردود الفعل من خلال إضافة 800 ميكرولتر من GUS وقف عازلة (0.2 م نا 2 CO 3).
- قياس مضان باستخدام قارئ لوحة في طول موجي 365 نانومتر من الإثارة وانبعاث موجة من 455 نانومتر وقارن بين القيم إلى منحنى معيارا MU. تقرير مستويات النشاط وGUS مجموع MU / ميكروغرام nmol ذوبان البروتين / دقيقة.
4. الأسهم والحلول :
- Acetosyringone (1 م) سهم (FW = 196.2 ز)
- الكانامايسين (100 ملغ / مل) المخزون -- إعداد درهم في 2 0 -- فلتر تعقيم
- ريفامبيسين (25 ملغ / مل) المخزون -- إعداد في DMSO
- لوريا ، Bertani النمو السائل (LB) وسائل الإعلام : (1L)
1 ٪ (W / V) bacto - تريبتون ، 10 ز
0.5 ٪ (W / V) bacto ، خلاصة الخميرة ، 5 ز
170 كلوريد الصوديوم 10 مم ز
الحموضة -- 7 - Acetosyringone (25 ميكرومتر) = 25 ميكرولتر من مخزون M 1 في النهائي لحجم 1 مل
- متوسطة تسلل : (1L)
10 ملي MgSO 4 2 0 0.7 درهم (FW = 246،48 ز) و 2.4648 ز
9 ملم زارة التربية والعلم (FW = 213،25 ز) ، 1.91925 ز
الحموضة -- 5.6 - Acetosyringone (100 ميكرومتر) = 100 ميكرولتر من مخزون 1M في الحجم النهائي من 1 مل
- GUS استخراج الاحتياطي
50 ملي NaPi الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 10 ملي EDTA ، 0.1 ٪ تريتون X - 100 ، 0.1 ٪ N - lauroylsarcosine ملح الصوديوم ، β - المركابتويثانول (0.7 ميكروليتر / مل) - 2X الفوسفات عازلة
ناه 0.2M 2 ص 4 و 0.2 م 2 نا هبو 4 درجة الحموضة 7 - X - الحلاوة ركيزة الحل
حل 1 ملغ من 5 - 4 - برومو كلورو - 3 - BD - indolyl غلوكورونيد (X - الغلوكوز) في الميثانول مل 0.1. إضافة 1 مل من الفوسفات 2X العازلة ، 20 ميكرولتر فيري سيانيد البوتاسيوم 0.1M ، 10μl تريتون X - 100 10 و 850 ٪ من المياه المقطرة ميكرولتر.
5. ممثل النتائج :
بعد هذا البروتوكول ، ومن المتوقع فقدان التعبير GUS عندما يحدث موت الخلايا. أعربنا في الوقت نفسه على الجين المراسل ، β غلوكورونيداز (GUS) مع أحد أعضاء Arabidopsis خلوي واقية بي سي إل 2 المرتبطين athanoGene (BAG) الأسرة. شاركنا في تسلل N. benthamiana يترك مع 35S مدفوعة BAG الكاسيت التعبير وناقلات GUS pCAMBIA 2301 باستخدام الأجرعية LBA4404 السلالة. وكما هو مبين في الشكل 2 ، لاحظ زيادة ملحوظة في تلطيخ GUS بعد هذا التسلل. على العكس ، عندما كان يعرف الموالي لأفكارك عضوا من عائلة بي سي إل 2 استخدمت BAX ، لوحظ انخفاض ملحوظ في تلطيخ GUS (الشكل 2). في كل حالة من هذه الحالات ، كانت مختلفة بشكل واضح GUS التعبير بالمقارنة مع السيطرة. ومع ذلك ، عند الاختلاف في التعبير هو أقل وضوحا ، يمكن إجراء فحوصات MUG fluorometric لquanitate GUS التعبير.
الشكل 1. مثال على مزيج الأجرعية تسلل من الجانب مجافي المحور ن. benthamiana يترك باستخدام 1 مل إبرة حقنة أقل.
الشكل 2. وكان شارك في ناقلات GUS التي أعرب عنها في ن. benthamiana يترك مع الجينات المضادة للموت ، ومحفز معروف من موت الخلية. وتمت مقارنة مستويات GUS لمكافحة ناقلات فارغة (GUS التحكم).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | VWR international | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4’-hydroxy-3’,5’-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR international | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR international | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR international | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR international | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR international | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR international | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR international | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR international | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma-Aldrich | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR international | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone(MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR international | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
