Summary
程序性细胞死亡，DNA梯状或TUNEL法检测，如哺乳动物系统常用的检测往往难以重现植物。 GUS报告制度相结合，我们提出一个快速的，植物的瞬态检测，分析特定基因的潜在死亡属性。
Abstract
我们已经开发出一种新的瞬态植物表达系统，同时表达报告基因β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的细胞死亡与公认的积极或消极的监管机构，。在这个系统中，N benthamiana叶渗透与35S驱动的表达，其中包含要分析的基因磁带，GUS载体pCAMBIA 2301使用车辆农杆菌菌株LBA4404。由于活细胞所需的GUS基因表达发生，GUS活性的损失预计时，这个标记基因与细胞死亡的积极监管机构的合作表示。同样，增加的GUS活性是观察时使用抗凋亡基因相比，矢量控制。如下图所示，我们已经成功地在我们的实验室中使用这个系统来分析亲和抗死亡的球员。这些措施包括植物抗凋亡的Bcl - 2的相关athanoGene（袋）的家庭，以及，如BAX已知的哺乳动物的细胞死亡诱导，。此外，我们已经用这个系统来分析具体截断内蛋白质死亡的功能，可提供线索，这些蛋白质可能的翻译后修饰/激活。在这里，我们提出一种快速，敏感的植物为基础的方法，如在初步调查的特定基因的死亡功能第一步。
Protocol
benthamiana烟草植物生长温度控制在25 ° C时生长室。使用3-6周老植物叶片完全展开的健康。
提示：通过使用新兴的叶子获得更好的成果
1。农杆菌介导的瞬态渗透协议：
第1天
- 农杆菌介导的基因（S）来检测细胞死亡和载体，含有适当的载体（应变农杆菌）的甘油库存数的LB /利福平（25微克/毫升）/卡那霉素（100微克/毫升）的琼脂平板构推下的GUS的录像带。始终包括空载体作为阴性对照的控制。
- 孵育28 ° C为2天。
第3天
- 接种2毫升/利福平/卡那霉素板以前挑染LB从每个单菌落含利福平（25微克/毫升）和卡那霉素（100μg/ ml的）的LB。
- 孵育晃动在28 ° C直到24小时在200转达到最大生长密度是每一种文化。
提示：结块，有时观察，在这种情况下，文化需要彻底的重新悬浮在出发前（即上下吹打起来） 。
第4天
- 潜伏期之后，增加的总体积至10 mL新鲜的LB（含适当的抗生素）和乙酰丁香酮（终浓度为25微米）。
- 另外16小时在28 ° C摇晃孵育每一种文化。
第5天
- 以下一天洗两次每一种文化在4000 XG在室温为10分钟，加入10毫升（不添加乙酰丁香酮）渗透介质（10毫米硫酸镁4 0.7 H 2 O，9毫米的MES，pH值5.6）和离心机。
- 最后的离心步骤后，重悬在5毫升渗透介质中含有乙酰丁香酮（100微米）的每一种文化。
- 测量OD 600nm处 ，测量0.1和0.9之间是可以接受的的。
提示：低至0.1 OD 600nm处有没有问题，但是，更高的消耗臭氧层物质可能会产生更一致的结果。 - 孵育3个多小时的文化准备农杆菌感染的文化。
- 混合文化包含的基因（S）进行分析和负控制在1:1与文化包含的GUS盒的比例（含空载体的农杆菌介）。
- 渗透的新兴使用1毫升的针头的注射器（图1）叶的背面（下）方。
提示：渗透阴性对照的混合物（空载体+ GUS的卡带）和包含要检测基因（基因X + GUS的卡带）对面的同种植物叶的混合物 。 每处理一式三份植物。 - 3天渗透后消费渗入叶片GUS蛋白表达和检测。
2。组织化学GUS分析
第8天
- 真空渗入切除叶的X - gluc基板介质。
- 在黑暗中孵育，室温过夜，直到出现明显的蓝染色。
第9天
- distillated水冲洗。
- 在70％的乙醇孵育直到叶绿素被删除，然后再次转移到蒸馏水。目视评估GUS基因表达水平。
3。荧光杯测定：
第8天
- 隔离磨在使用液氮的砂浆渗入叶圆片总蛋白。新增100 UL GUS提取缓冲液（50毫米NAPI pH值7.0，10 mM的EDTA，0.1％TRITON X - 100，0.1％的N - lauroylsarcosine钠盐，β-巯基乙醇（0.7μL/毫升），同时保持冰样本。
- 在14000克离心悬浮液在4 ° C 5分钟，取上清液可溶性总蛋白。
- 根据制造商的指示使用nanodrop测量浓度。
- 调整蛋白浓度到100微克每个使用GUS提取缓冲液的样品的总可溶性蛋白的。
- 添加杯（4 methylumbelliferyl -β- D -葡糖苷酸三水）准备GUS提取缓冲液中终浓度为2毫米的基板。每个样品100μL（蛋白质+杯基板）的总量应该足够了。
- 1小时的反应在37 ° C。
- 加入800μLGUS终止缓冲液（0.2 M NA 2 CO 3）停止反应。
- 测量荧光激发波长为365 nm和发射波长为455纳米和穆标准曲线比较值的一个使用酶标仪。 GUS活性的报告nmol MU /μg总可溶性蛋白/分钟的水平。
4。股票和解决方案：
- 乙酰丁香酮（1米）股票（FW = 196.2克）
- 卡那霉素（100毫克/毫升）的股票-准备在卫生署2 0 -过滤消毒
- 利福平（25毫克/毫升）的股票 - 准备在DMSO
- 卢里亚Bertani（LB）液体生长介质：（1L）
1％（W / V）细菌用胰蛋白胨，10克
细菌用的酵母提取物0.5％（W / V），5克
170毫米，氯化钠10克
pH值 - 7 - 乙酰丁香酮（25μM）= 1米的股票最终体积为1 mL 25μL
- 渗透介质：（1L）
10毫米硫酸镁4 0.7 DH 2 0（FW = 246.48克），2.4648克
9毫米MES（FW = 213.25克），1.91925克
pH值 - 5.6 - 乙酰丁香酮（100μM）= 100μL一个1M股票，最终体积为1 mL
- GUS提取缓冲液
50 mM的那匹pH值7.0，10 mM的EDTA，0.1％TRITON X - 100，0.1％的N - lauroylsarcosine钠盐，β-巯基乙醇（0.7μL/毫升） - 2X磷酸盐缓冲液
0.2M的NaH 2 PO 4和0.2 M娜2 HPO 4 pH值7 - X - Gluc底物溶液。
溶解1毫克的5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚BD -葡糖苷酸（X - Gluc）0.1毫升甲醇。添加1毫升2X磷酸缓冲液，20微升0.1M铁氰化钾，加入10μlTRITON X - 100的10％和850μLdistillated水。
5。代表性的成果：
根据这一协议，GUS表达的损失预计时发生细胞死亡。我们同时表示，记者的基因，与细胞质保护拟南芥BCL - 2相关athanoGene（袋）系列的成员β-葡萄糖醛酸酶（GUS ）的。我们的合作渗透北路benthamiana离开一个35S驱动包表达盒和使用农杆菌菌株LBA4404 GUS载体pCAMBIA 2301。正如图2所示，在GUS染色明显增加之后，观察到这种渗透。相反，当已知的促凋亡的Bcl - 2家族成员伯灵顿使用，被观察的GUS染色明显减少（图2）。在这两种情况下，GUS表达比对照明显不同。然而，在表达上的差异不太明显时，荧光杯检测可以进行quanitate GUS表达。
图1。 农杆菌N.背面一侧的混合物渗透的范例benthamiana叶使用1毫升的针的注射器。
图2。一个GUS载体，共同表达在 N benthamiana叶与反死亡的基因，称为诱导细胞死亡。 GUS的水平相比，一个空向量控制（控制的GUS）。
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Discussion
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | VWR international | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4’-hydroxy-3’,5’-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR international | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR international | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR international | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR international | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR international | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR international | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR international | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR international | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma-Aldrich | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR international | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone(MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR international | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
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