Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Een β-glucuronidase (GUS) Op basis Dood van de Cel Assay

Published: May 6, 2011 doi: 10.3791/2680

Summary

Geprogrammeerde celdood assays gebruikt in zoogdieren systemen zoals DNA laddering of TUNEL testen, zijn vaak moeilijk te reproduceren in planten. In combinatie met een GUS verslaggever systeem, stellen wij voor een snelle, plant op basis van voorbijgaande test om de mogelijke dood eigenschappen van specifieke genen te analyseren.

Abstract

We hebben een nieuwe tijdelijke plant expressie systeem dat tegelijkertijd drukt de reporter-gen, β-glucuronidase (GUS), met een vermeende positieve of negatieve regulatoren van celdood. In dit systeem, N. benthamiana bladeren zijn co-geïnfiltreerd met een 35S gedreven expressiecassette met het gen te analyseren, en het GUS vector pCAMBIA 2301 met behulp van Agrobacterium-stam LBA4404 als een voertuig. Omdat de levende cellen nodig zijn voor GUS expressie te komen, is het verlies van GUS-activiteit te verwachten wanneer deze marker-gen is co-uiting met positieve regulatoren van celdood. Even, verhoogde GUS activiteit wordt waargenomen wanneer anti-apoptotische genen worden gebruikt in vergelijking met de vector te controleren. Zoals hieronder wordt weergegeven, hebben we met succes gebruikt dit systeem in ons lab om zowel pro-en anti-dood-spelers te analyseren. Deze omvatten de plant anti-apoptotische Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) familie, maar ook, bekende zoogdieren induceren van celdood, zoals BAX. Daarnaast hebben we gebruikt dit systeem om de dood functie van specifieke afknottingen in eiwitten, die aanwijzingen kunnen geven over de mogelijke post-translationele modificatie / activering van deze eiwitten te analyseren. Hier presenteren wij een snelle en gevoelige planten gebaseerde methode, als een eerste stap in het onderzoek naar de dood functie van specifieke genen.

Protocol

Nicotiana benthamiana planten worden gekweekt in een temperatuur-gecontroleerde groei kamer bij 25 ° C. Volledig uitgebreid gezonde bladeren van 3-6 week oude planten worden gebruikt.

Tip: Betere resultaten worden verkregen met behulp van nieuw opkomende bladeren

1. Agrobacterium voorbijgaande infiltratie protocol:

Dag 1

  1. Streak LB / Rifampicine (25 ug / ml) / kanamycine (100 ug / ml) agarplaten met glycerol voorraden van Agrobacterium tumefaciens (stam LBA4404) met de geschikte vectoren met het gen (s) te worden getest op celdood en de vector met GUS de cassette onder een constitutieve promotor. Altijd een lege vector controle als een negatieve controle.
  2. Incubeer bij 28 ° C gedurende 2 dagen.

Dag 3

  1. Inoculeren 2 ml LB met Rifampicine (25 ug / ml) en kanamycine (100 ug / ml) met een enkele kolonie van elkaar LB / Rifampicine / Kanamycine plaat eerder strepen.
  2. Incubeer elke cultuur door schudden bij 28 ° C voor 24 uur bij 200 rpm tot maximale groei dichtheid is bereikt.

Tip: Klontvormende wordt soms waargenomen, in welk geval culturen moeten grondig worden geresuspendeerd (dat wil zeggen en neer te pipetteren) voordat u verder gaat.

Dag 4

  1. Na de incubatie, streeft het totale volume tot 10 ml met verse LB (met de juiste antibiotica) en acetosyringone (eindconcentratie 25 uM).
  2. Incubeer elke cultuur door schudden bij 28 ° C voor een ander 16 uur.

Dag 5

  1. De volgende dag twee keer te wassen elke cultuur door het toevoegen van 10 ml (niet toe te voegen acetosyringone) infiltratie medium (10 mM MgSO 4 0.7 H 2 O, 9 mM MES, pH 5.6) en gecentrifugeerd bij 4000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  2. Na de laatste centrifuge stap, opnieuw in suspensie elke cultuur in 5 ml infiltratie medium dat acetosyringone (100 uM).
  3. Meet de OD 600 nm, metingen tussen 0,1 en 0,9 aanvaardbaar zijn.
    Tip: OD 600 nm van zo laag als 0.1 zijn gebruikt zonder een probleem is echter, kunnen hogere ODS produceren meer consistente resultaten.
  4. Incubeer de drie culturen voor meer uur naar de Agrobacterium culturen voor infectie te bereiden.
  5. Meng culturen die het gen (s) te worden geanalyseerd en de negatieve controle (Agrobacterium met de lege vector) in een 1:1 verhouding met de cultuur die het GUS cassette.
  6. Infiltreren in de abaxiale (onder) kant van nieuw opkomende bladeren met behulp van een 1 ml naald-less spuit (afb. 1).
    Tip: Infiltreer zowel de negatieve controle mengsel (lege vector + GUS cassette) en het mengsel dat het gen te worden getest (gen x + GUS cassette) aan de tegenoverliggende bladeren van dezelfde plant. Gebruik drievoud planten voor elke behandeling.
  7. 3 dagen na de infiltratie accijnzen bladeren en test geïnfiltreerd voor GUS eiwit expressie.

2. Histochemische GUS-test

Dag 8

  1. Vacuüm infiltreren van de X-Gluc substraat medium in het weggesneden bladeren.
  2. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur 's nachts, of totdat duidelijk blauwe vlekken verschijnt.

Dag 9

  1. Spoel in gedestilleerd water.
  2. Incubeer in 70% ethanol tot chlorofyl wordt verwijderd, dan weer over te dragen aan gedestilleerd water. Visueel beoordelen GUS expressie niveaus.

3. Fluorometrische MUG-test:

Dag 8

  1. Isoleer totaal eiwit door het malen geïnfiltreerd bladschijfjes in een vijzel met behulp van vloeibare stikstof. Voeg 100 uL van GUS extractiebuffer (50 mM Napi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-lauroylsarcosine natriumzout, β-mercapto-ethanol (0,7 ul / ml), terwijl het monster op het ijs.
  2. Centrifugeer suspensie bij 14.000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en neem supernatant als totaal oplosbaar eiwit.
  3. Meet de concentratie door middel van een nanodrop volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Stel de eiwitconcentratie tot 100 pg totaal oplosbaar eiwit voor elk monster met behulp van GUS extractiebuffer.
  5. Voeg MUG substraat (4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide trihydraat) bereid in GUS extractiebuffer tot een uiteindelijke concentratie van 2 mm. Een totaal volume van 100 ul per monster (eiwit + MUG-substraat) moet voldoende zijn.
  6. Incubeer de reacties gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  7. Stop reacties door het toevoegen van 800 pi van GUS stop buffer (0,2 M Na 2 CO 3).
  8. Meten fluorescentie behulp van een plaat lezer op een golflengte van 365 nm en emissie golflengte van 455 nm en vergelijk waarden om een ​​MU standaard curve. Rapport niveaus van GUS activiteit als nmol MU / ug totaal oplosbaar eiwit / min.

4. Voorraden en oplossingen:

  1. Acetosyringone (1 M) voorraad (FW = 196,2 g)
  2. Kanamycine (100 mg / ml) voorraad - voor te bereiden in dH 2 0 - filter steriliseren
  3. Rifampicine (25 mg / ml) voorraad - voor te bereiden in DMSO
  4. Luria-Bertani (LB) vloeibare groei media: (1L)
    1% (w / v) Bacto-trypton, 10 g
    0,5% (w / v) Bacto-gistextract, 5 g
    170 mM natriumchloride 10 g
    pH - 7
  5. Acetosyringone (25 uM) = 25 ui van een 1 M voorraad in een eindvolume van 1 ml
  6. Infiltratie Medium: (1L)
    10 mM MgSO 4 0,7 dH 2 0 (FW = 246,48 g), 2,4648 g
    9 mM MES (FW = 213,25 g), 1,91925 g
    pH - 5,6
  7. Acetosyringone (100 uM) = 100 ul van een 1 M voorraad in een eindvolume van 1 ml
  8. GUS extractiebuffer
    50 mM Napi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-lauroylsarcosine natriumzout, β-mercapto-ethanol (0,7 ul / ml)
  9. 2x Fosfaat buffer
    0,2 M NaH 2 PO 4 en 0,2 M Na 2 HPO 4 pH 7
  10. X-Gluc substraatoplossing
    Los 1 mg van 5-broom-4-chloor-3-indolyl bd-glucuronide (X-Gluc) in 0,1 ml methanol. Voeg 1 ml 2x fosfaatbuffer, 20 ui 0,1 M kaliumferricyanide, 10μl Triton X-100 10% en 850 ul van gedestilleerd water.

5. Representatieve resultaten:

Naar aanleiding van dit protocol, is het verlies van GUS-expressie verwacht bij celdood optreedt. We hebben tegelijkertijd uitgesproken het reporter-gen, β-glucuronidase (GUS), met een lid van de cyto-beschermende Arabidopsis Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) familie. We co-geïnfiltreerd N. benthamiana bladeren met een 35S gedreven BAG expressiecassette en de GUS vector pCAMBIA 2301 met behulp van Agrobacterium-stam LBA4404. Zoals weergegeven in figuur 2, is een zichtbare toename van de GUS-kleuring waargenomen na deze infiltratie. Omgekeerd, wanneer de bekende pro-apoptotische lid van de Bcl-2 familie BAX werd gebruikt, was een duidelijke vermindering van de GUS-kleuring waargenomen (afb. 2). In beide gevallen, GUS expressie was zichtbaar anders vergeleken met de controlegroep. Echter, wanneer het verschil in uitdrukking is minder evident, kan fluorometrische MUG testen worden uitgevoerd om GUS expressie quanitate.

Figuur 1
Figuur 1. Voorbeeld van een Agrobacterium mengsel infiltratie van de abaxiale kant van N. benthamiana laat met behulp van een naald 1 ml-spuit minder.

Figuur 2
Figuur 2. Een GUS vector werd co-uitgedrukt in N. benthamiana bladeren met de anti-dood-gen, en een bekende inductor van celdood. GUS niveaus werden vergeleken met een lege vector control (GUS controle).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rifampicin VWR international IC19549001 25mg/mL stock in DMSO
4’-hydroxy-3’,5’-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) VWR international TCD2666 0.981 g/mL in DMSO (1M stock)
2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) VWR international EM-6110 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media
Bacto-tryptone Fisher Scientific BP1421-2 10g/L in water for making 1 L of LB medium
Bacto-yeast extract VWR international EM1.03753.0500 5g/L in water for making 1 L of LB medium
Sodium chloride VWR international EM-7710 10g/L in water for making 1 L of LB medium
Sodium phosphate monobasic monohydrate VWR international MK-7868-12 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi
Sodium phosphate dibasic heptahydrate VWR international EMD-SX0715-1 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi
Magnesium sulfate heptahydrate VWR international EM-MX0070-1 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media
N-Lauroylsarcosine VWR international TCL0151-500G 0.1% v/v in GUS buffer
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) Gold Biotechnology G1281C 1mg/100uL in methanol 100%
4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) Sigma-Aldrich M5664 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer
Potassium ferrocyanide trihydrate VWR international EM-PX1460-1 100mM stock for X-gluc substrate solution
β-Methylumbelliferone(MU) Sigma-Aldrich M1381 For MU standard curve use GUS extraction buffer
Sodium carbonate VWR international EM-SX0395-11 0.2 M in water for making GUS stop buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
  2. Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
  3. Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).
  4. Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
  5. Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
  6. Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
  7. Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
  8. Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
  9. Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
  10. Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).

Tags

Plant Biology celdood GUS transiënte expressie Nicotiana benthamiana.
Een β-glucuronidase (GUS) Op basis Dood van de Cel Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kabbage, M., Ek-Ramos, M., Dickman,More

Kabbage, M., Ek-Ramos, M., Dickman, M. A β-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay. J. Vis. Exp. (51), e2680, doi:10.3791/2680 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter