Summary
שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.
Abstract
בתאי גזע עצביים (NSCs) מתגוררים יחד neuroepithelium אזור חדרית במהלך הפיתוח של הצלחת קליפת המוח. אלה אבות מוקדם בסופו של דבר להצמיח אבות ביניים מאוחר יותר, תת שונים תא עצב גליה היוצרות את קליפת המוח. היכולת ליצור ולהרחיב NSCs האנושי (מה שנקרא neurospheres) מרקמות מושלך העובר נורמלי מספק אמצעי שבעזרתו ישירות במחקר היבטים פונקציונליים של אדם נורמלי NSC פיתוח 1-5. גישה זו יכולה גם להיות מכוונת כלפי דור NSCs מהפרעות נוירולוגיות ידוע, ובכך והנותן את ההזדמנות כדי לזהות תהליכים המשנים התפשטות מחלת אבי, הגירה בידול 6-9. התמקדנו בזיהוי מנגנוני פתולוגיים האדם NSCs תסמונת דאון שעשוי לתרום פנוטיפ המחלה אלצהיימר מואצת 10,11. גם in vivo ולא במודלים חוץ גופית העכבר יכול לשכפל את הרפרטואר זהה של גנים בכרומוזום האנושי 21.
כאן אנו משתמשים בשיטה פשוטה ואמינה כדי לבודד תסמונת דאון NSCs מ בוטלה קליפת המוח העוברי האנושי לגדל אותם בתרבית. מתודולוגיה מספקת להיבטים ספציפיים של קצירת לנתיחה, רקמה עם ציוני דרך אנטומיים מוגבל, מיון התא, ציפוי passaging NSCs של האדם. אנו מספקים גם כמה פרוטוקולים בסיסיים גרימת הבחנה של NSCs האדם לתוך תת תא בררניים יותר.
Protocol
1. ההכנה של פתרונות וחומרים לנתיחה ותחזוקה של תרבות גזע עצביים תא
- הכן 100 מ"ל בינוני דיסקציה (בנוקאאוט DMEM/F12, Invitogen) מראש ושומרים במקרר.
- Prepare100 מ"ל בינוני תרבות (גזע Pro NSC SFM, Invitrogen) ולשמור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- הכן תא הקפאה בינוני (בנוקאאוט DMEM/F12 10% FBS + DMSO 5%) עבור cryopreservation ארוך טווח של תאים.
- אם תרצה, להכין paraformaldehyde 4% (PFA) עבור קיבעון רקמות.
- סטרילי, מלקחיים autoclaved ולהבי אזמל עם ידיות משמשים לניתוח.
- מניחים בצד אקדח פיפטה, 10 מ"ל pipettes ההעברה, ו -40 מיקרומטר תא מסננת (BD פלקון 352340) על ניתוק.
- מניחים בצד כמה 10 ס"מ תרבות מנות (BD) לנתיחה, 50 מ"ל צנטריפוגות מבחנות (BD) עבור דיסוציאציה, 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל לאחסון רקמות צלוחיות קפוא (BD) עבור תאים מקפיא.
2. בידוד אנושי בתאי גזע עצביים מהמוח עוברי אדם
- קציר של רקמת קיימא מיד לאחר סיום של העובר היא חיונית להצלחת התהליך. עבור פרוצדורות אלקטיבי, העיתוי להשיג דגימות ניתן לתאם מראש כדי לצמצם את זמן לאחר מותו של העובר. המוצרים ההתעברות נקצרים בתוך הליך שעות 2 הודעה, אבל באופן אידיאלי ניתן להשיג על הליכי בחירה בתוך דקות. ברקמות העובר לעתים קרובות הם מקוטעים. עם זאת, באופן כללי חלק ניכר של המוח נשאר שלם לצורך זיהוי חזותי. מגבלות גיל ההריון (GA) נקבעים על פי חוק סטטוטורי, אך בוצעו תוך שימוש בפרוטוקול זה בין 18-22 שבועות GA.
- מוח עוברית ממוקם צלחת פטרי 10 מ"ל המכיל קר כקרח DMEM/F12 פתרון בנוקאאוט. זיהוי חלקים שונים של קליפת המוח על ידי ציוני דרך אנטומיים. גבולות עבור הקורטקס פרונטלי parieto-העורפית מכוונים ידי הצטלבות אקסטרפולציה של מענית המרכזי סדק סילביוס. לנתח רקמה של הקליפה המצחית הקדמית של מענית המרכזי לאורך הגבול של הסדק סילביוס עם להבים כירורגית, והקפד לשמור על החדר בשלמות וללא נזק.
- הסר את כל שאריות הדם ואת קרומי המוח מהגוש מופרדים של קליפת המוח הקדמית. אם המדגם הוא באיכות מספקת, הוא אידיאלי לנתח את הבלוק לתוך כמה דוגמאות קטנות למטרות שונות: סעיפים (קבוע paraformaldehyde 4%, PFA) וחלבון / מבחני ה-mRNA (קפוא מהיר -80 ° C).
- מעבירים את גוש במוח שנבחרו צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, ולהוסיף קר כקרח DMEM/F12 פתרון בנוקאאוט בערך 3 פעמים הנפח של רקמות. בעדינות לנתק את הרקמה על ידי pipetting מכני עם טפטפת להעביר עד 10 מ"ל כל הרקמות נעשית מקוטעת (בדרך כלל 20-30 פעמים), ואז לסנן את התאים באמצעות תא 40 מיקרומטר מסננת (BD פלקון 352340) להשיג תא בודד אחד או ליד ההשעיה.
- צנטריפוגה ההשעיה תא בסל"ד 2000 ו בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל טרי בינוני תרבות חמים (גזע Pro NSC SFM), וכן לספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer.
- הוסף 5 מ"ל תרבות מדיום חם לתוך כל 25 ס"מ 2 צלוחיות תרבות, ולהעביר 2x10 6 תאים בקבוק אחד. תרבויות נשמרות 37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור במשך שבוע 1 לפני הניתוח. שינוי במחצית בינוני פעם בשבוע במשך תרבויות או ניסויים נוספים.
3. Manipulaton בתאי גזע עצביים לאפיון או experimentations נוסף
- Neurospheres בדרך כלל הטופס 1-2 שבועות בתנאים תרבות מומלץ בקוטר NSC הנעים בין 200 ל 400 מיקרומטר. Neurospheres בשלב זה יכולה להיות מנותקת עם 0.2 g / L EDTA בסידן ומגנזיום חינם הנקס בינוני (הנקס) בשעה 37 ° C במשך 15 דקות כדי להשיג תאים בודדים. ההשעיה תאים הם הסתחררו ב 2000 סל"ד, ושטף הנקס טריים, replated במדיום חמים תת תרבות.
- כדי ליזום בידול, הם תאים ניתק מצופה על poly-D-lysine/laminin 1 coverslips מצופה בצפיפות של 5 תאים לכל coverslip 1x10 (24mmX24mm). בידול Oligodendrocyte מושגת על ידי שמירה על תאים בנוקאאוט DMEM/F12 (Invitrogen, ראשי, MD) 2% B27 (50X, Invitrogen, ראשי, MD) 10 ng / ml bFGF 100 ng / ml ששש + 10ng/ml PDGF-AA ל 2days, ולאחר מכן מעבר המדיום זהה ללא גורמי גדילה לעוד 5 ימים. בידול העצבית מושגת על ידי תאים שמירה ב בנוקאאוט DMEM/F12 2% B27 (50X) למשך 7 ימים. בידול Astrocyte נעשית על ידי תאים culturing ב בנוקאאוט DMEM/F12 FBS 1% במשך שבוע.
- Transfection בתאי גזע עצביים עם גנים ניתן לעשות עם תאים ניתק מן preformed neurospheres. הנה, הראינו שתאי הגזע העצביים transfected עם EGFP-C1 ידי electroporation. Electroporation של EGFP-C1 לבנות נעשה באמצעות AMAXA ערכות Nucleofector עבור תאים עכבר גזע עצביים (VPG-1004) עם התקן Nucleofector AMAXA (Lonza AAD-1001), בעקבות הוראה של החברה. בקיצור, ה-DNA 5 מיקרוגרם עם 1 X 10 6 תאים היו מעורבים עם בינוני 100 transfection μl, ולאחר electroporation הדופק, התאים היו resuspended בתאי גזע עצביים שמירה בינוני לתרבות נוספת. התמיינות של תאים transfected עובדו עם ניתוק של ימים neurospheres 3-4 לאחר electroporation, בעקבות אותם הליכים המתוארים בשלב 3.2.
4. הקפאת בתאי גזע עצביים תת תרבות
- המתלים התא ניתק הם centrifuged ו resuspended במדיום הקפאה עם ריכוז של 1x10 7 תאים / בקבוקון / ml. לאט לאט להקפיא את התאים -20 ° C, -80 ° C ואז להעביר חנקן נוזלי לאחסון זמן רב.
- התאים הם הפשירו מהר עם 37 מעלות צלזיוס באמבט מים resuspended ב חימם DMEM/F12 10% נסיוב עבור לשטוף, centrifuged להסיר את הקפאת בינוני, ו resuspended במדיום תרבות התחמם.
5. נציג תוצאות:
בתאי גזע עצביים של עובר נורמלי בגיל 18 שבועות גיל הריון היו בתרבית הבאים בשיטות המתוארות ו neurospheres ניתן לראות אחרי שבוע אחד עם סיבוב, גבולות חלקה בגודל אחיד למדי (Fig.2A). Neurospheres אלה יכולים להיות transfected עם EGFP-C1 או מבנים אחרים אחריו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Fig.2B,). Neurospheres הוקמה היו אז ניתק עם EDTA ו מצופה כמו תאים מפוזרים על coverslips מצופה. תאים מובחנים לפי הפרוטוקולים השונים נקבעו עם parafamaldehyde 4% ו מוכתם סמנים שונים סוג תא מסוים. Multipotentiality הוא ציין עם ביטוי של סמנים המעידים על נוירונים (Fig2C, D, rhodamine) האסטרוציטים (Fig2E, F, rhodamine) ו oligodendrocytes (Fig2G, H, rhodamine). התאים לא עברו electroporation של EGFP היו מובחנים גם לתוך תאים מסוגים שונים ומוכתמת עם סמנים ספציפיים תאים שונים. Multipotentiality הוא ציין עם ביטוי של סמנים המעידים על נוירונים (Fig3A, B, fluoroscein) האסטרוציטים (Fig3C, rhodamine ו Fig3D, fluoroscein) ו oligodendrocytes (Fig3E, F, rhodamine).
באיור 1. סכמטי של תהליך הניסוי לבודד בתאי גזע עצביים מהמוח מושלך עוברי אדם
איור 2. מובחן הבדיל תאים עצביים propogated אדם במבחנה. (א) Neurospheres מוצגים תחת מיקרוסקופ לעומת שלב להדגים חלק, עגול גבולות הצמיחה המהירה אחרי התרבות למשך שבוע מעל 1. (ב) הכנסת פלסמידים ובונה שונים יכולה להיות מושגת באמצעות transfection. שלושה ימים לאחר transfection EGFP-C1, מספר תאים מראים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק כפי שניתן לראות תחת immunostaining fluoroscein ו מיקרוסקופ פלואורסצנטי. EGFP-C1 neurospheres transfected הם ניתק הבדיל בתנאים שונים לתוך הנוירונים (C, D), האסטרוציטים (E, F) oligodendrocytes (G, H) וראה תחת הקרינה rhodamine. במקביל, transfected תאים EGFP חיובי מוצגים תחת fluoroscein פלואורסצנטי. תאים transfected (ראשי חץ לבן) הם נבדלים מתאי untransfected (חצים לבנים). גרעין התא מגואלות Hoechst33342. ברים הם סולם 200 מיקרומטר עבור, 100 מיקרומטר עבור B ו 25 מיקרומטר עבור CH.
איור 3. Neurospheres ללא transfection הם ניתק הבדיל בתנאים שונים לתוך הנוירונים (A, B, fluoroscein), האסטרוציטים (C, rhodamine, D, fluoroscein) ו oligodendrocytes (E, F, rhodamine). גרעין התא מגואלות Hoechst33342. ברים סולם הם 25 מיקרומטר עבור AF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנן גישות שונות כלפי רקמות תרבות טריים לייצר שורות תאים אנושיים. מבחינה היסטורית, רקמה טרי כבר קוצרים ותרבותיים מיד לייצר תאים מסוגים שונים במערכת העצבים המרכזית. אולם גישה זו היא מוגבלת בבירור במספר דגימות שניתן להשיג, אשר במקרה של דגימות האדם, הוא בדרך כלל קטן למדי. בהתחשב במידה מינימלית של מניפולציה, בתרבית תאים עצביים טרי לספק את מערכת ניסיונית אמין ביותר על ידי הגבלת חפצי פוטנציאליים culturing המורחבת. היצע מוגבל הוביל לגישה השנייה של יצירת שורות תאים אנושיים שהיו הונצח באמצעות החדרת אונקוגנים שונים 12, 13. הדאגה גישה זו טמון האפשרות מניפולציה בשעור של תאים אלה היו לשנות את המאפיינים תאים. בנוסף, חלק הרציונל ליצירת שורות תאים אנושיים היה פוטנציאל להשתלה וטיפול בהפרעות אדם שונים. שורות תאים הנציח יכול להשפיע על הסיכון של צמיחת סרטן. היתרון אלה שורות תאים הוא אחידות השורות, היכולת שלהם לאמץ את פנוטיפים עצב גליה שונים הטמון באזור של המוח, ואת הקלות של יצירת מספר רב של תרבויות. כדי להתגבר על המגבלות בשעור פוטנציאל, גישות שונות שימשו העיקרי culturing תאים עצביים גזע אנושי. רוב השיטות מבוססות על EGF ומניפולציה bFGF תאים, עם הדבקה או תרבות טכניקות ההשעיה. אלו גישות שונות לגרום purities שונים של המל"ל 14. סוונדסן et al. דיווח שיטה של התרבות של המועצה לביטחון לאומי לפי סעיף neurospheres שנוצר עם תאים תאים הקשר נשמר (15), אשר יכול לתת הפקה עשירה של NSC בתוך זמן קצר. עם זאת, oligodendrocyte לא ניתן להשיג עם אלה neurospheres במעברים מאוחר יותר. Neurospheres העשרת עם EGF ו bFGF יכול גם לשנות את פנוטיפים תעתיק ו הסלולר במבחנה 14. שימוש תרבויות מעבר מוקדם מספק פשרה סבירה בין הצורך כמויות גדולות של תרבויות החשש לפחות המבוא של חפץ תרבות. לאחרונה, מקדמות נעשו הדור בתאי גזע pluripotent המושרה על ידי ביטוי מאולץ של משנה של הגנים הנדרשים כדי לשמור על מאפייני תא גזע. תאים IPS יש את היתרון של מתן כמויות גדולות של תאים אנושיים, כמו גם פוטנציאל ליצור את כל סוגי התאים המרכיבים את גוף האדם. נכון לעכשיו, זה היתרון האחרון גם עושה את זה מערכת מודל מושך פחות כי מנגנוני איתות להפוך את התאים לסוג תא מסוים (כלומר נוירונים forebrain) אינם ידועים.
השיטות שתוארו עבור הדור הנוכחי של NSCs האדם לספק כמה שינויים קלים מן הגישות שפורסם אחרים. רוב השיטות הקודמות להשתמש באמצעים אנזימטית או כימיים שונים של התא דיסוציאציה (טריפסין או papain) לנתק המל"ל מהקורטקס העובר. באופן כללי, לאור כמות גדולה של רקמה, אנו משתמשים טחינה דקה מכני עדין עם תא סינון עדין להשיג תאים בודדים קיימא אשר עברו מניפולציה מינימלית. יתר על כן, גישה זו מצמצמת את זמן מבציר רקמות culturing רקמות / אחסון, שהוא קריטי עבור דגימות אנושיות.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד אדם בתאי גזע עצביים מרקמות מושלך קליפת המוח הקדמית 7,9,10,11. המתודולוגיה של בידוד neurospheres משתנה מעט בין אדם ועכברים, עם הגישה המתוארת כאן אופטימיזציה לקבלת תא בודד השעיות בדגימות רקמה אנושית. ישנם כמה שיקולים בשימוש רקמה אנושית. בראש ובראשונה הוא הגבלת זמן לאחר פטירתו של העובר לפני תחילת ניתוק התא והקציר. בעיה זו ניתן לרכך על ידי תזמון מראש של הפלות בחירה דגימות שמירה על 4 ° C. שנית, חשוב לנסות לזהות נקודות ציון על ניתוק של רקמת קליפת המוח. לשם כך, כדאי ליידע את רופא ביצוע הליך הנפל כדי לנסות לשמור על שלמות המוח במידת האפשר. שלישית, חשוב להבין את קנה המידה של המוח העוברי האנושי אפילו 18-22 שבועות עולה בהרבה על זה של עכבר בוגר או אפילו עכברוש, ולכן, את הצורך לבצע את הניתוק, סינון, והכביסה עם מערכת תפוקה גדולה יותר (כלומר, כלי פלסטיק גדול, 10 מ"ל פלסטיק pipets לעומת pipets זכוכית מלוטשת, דגימות מרובות מעובד במקביל). רביעית, התאים ניתק מכנית זה לא הכרחי כדי לוודא את כל שברי הרקמה נעלמו. במקום זאת עדיף לצמצם טחינה דקה ככל האפשר, מתוך הבנה כי הסינון תסיר את שברי רצויות רקמות גדולות נפרד NSCs בודדים מן המדגם מספיק גדול עבור culturing. רביעית, ריאגנטים הנבחר מותאמים neurospheres האדם. לבסוף, oנה צריך לנסות לא להפריע תאים בודדים אחרי שהם מצופה, כדי למזער צבירה.
ברגע שתאי גזע עצביים האדם יצרו תחומי המשובטים, הם יכולים להיות מנותקים לתוך תאים בודדים, כמתואר לעיל, וכן passaged עצמית חידוש יכולות לקבוע או מובחן לתוך תאים מסוגים שונים באמצעות שילובים שונים של גורמי גדילה ו / או חלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: HD054347 ו NS063997-01 ל VLS. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרן לתאי גזע אמפייר סטייט דרך מדינת ניו יורק מחלקת הבריאות חוזה # C024324 כדי VLS בחלקו. הדעות הביעו כאן הם אך ורק של המחבר ואינן משקפות בהכרח את עמדת מועצת לתאי גזע האמפייר סטייט, מדינת ניו יורק מחלקת הבריאות, או את מדינת ניו יורק. VLS היא דוריס דיוק קלינית התפתחותית המדען חתן פרס. אנחנו גם להודות לפרופסור טימותי Vartanian עבור מתנתו של Anti-O1, Anti-O4 נוגדנים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D Systems | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D Systems | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell Signaling Technology | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | Dako | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| * Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA | |||
References
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
- Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O'Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
- Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
- Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
- Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
- Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
- Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down's syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
- Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
- Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
- Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r, Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
- Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
- Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
- Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).
