Summary
अलगाव और त्याग मानव भ्रूण cortical ऊतक से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के संस्कृति पर एक सरल और विश्वसनीय पद्धति में वर्णित है. ज्ञात मानव स्नायविक विकारों से व्युत्पन्न संस्कृतियों रोग सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में औषधीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक मंच प्रदान.
Abstract
तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) cortical थाली के विकास के दौरान निलय क्षेत्र neuroepithelium साथ रहते हैं. ये जल्दी progenitors अंततः मध्यवर्ती progenitors को जन्म दे और बाद में, विभिन्न neuronal और glial सेल उपप्रकारों कि प्रमस्तिष्क प्रांतस्था के रूप में. क्षमता उत्पन्न करने के लिए और त्याग सामान्य भ्रूण ऊतक से मानव एनएससी (तथाकथित neurospheres) का विस्तार एक साधन है, जिसके साथ सीधे सामान्य मानव एनएससी 1-5 विकास के कार्यात्मक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है. यह दृष्टिकोण भी जाना जाता है स्नायविक विकारों से एनएससी की पीढ़ी की ओर निर्देशित किया जा सकता है, जिससे रोग प्रक्रियाओं है कि पूर्वज प्रसार, प्रवास और 6-9 भेदभाव बदल की पहचान करने का अवसर affording. हम मानव डाउन सिंड्रोम एनएससी है कि त्वरित अल्जाइमर रोग 10,11 phenotype करने के लिए योगदान हो सकता है में रोग तंत्र की पहचान करने पर ध्यान केंद्रित किया है. न तो vivo में और न ही इन विट्रो माउस मॉडल में मानव 21 गुणसूत्र पर स्थित जीन के समान प्रदर्शनों की सूची को दोहराने कर सकते हैं .
यहाँ हम एक सरल और विश्वसनीय पद्धति का उपयोग करने के लिए डाउन सिंड्रोम एनएससी निरस्त मानव भ्रूण cortices से अलग और उन्हें संस्कृति में विकसित. पद्धति सीमित संरचनात्मक स्थलों, सेल छँटाई, चढ़ाना और मानव एनएससी के passaging के साथ ऊतक, विच्छेदन, संचयन के विशिष्ट पहलुओं प्रदान करता है. हम भी अधिक चयनात्मक सेल उपप्रकारों में मानव एनएससी के भेदभाव उत्प्रेरण के लिए कुछ बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Protocol
1. समाधान और सामग्री के विच्छेदन और तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति के रखरखाव के लिए तैयार
- 100ml विच्छेदन मध्यम (DMEM/F12 पीटा, Invitogen) समय से आगे की तैयारी और सर्द.
- Prepare100 मिलीलीटर संस्कृति (स्टेम प्रो एनएससी SFM, Invitrogen) मध्यम और 37 पर रखने ° सी एक पानी के स्नान में.
- कोशिकाओं की लंबी अवधि cryopreservation के लिए सेल ठंड मध्यम (DMEM/F12 10% पीटा FBS + 5% DMSO) तैयार करें.
- अगर वांछित, ऊतक निर्धारण के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करते हैं.
- बाँझ, autoclaved हैंडल के साथ संदंश और स्केलपेल ब्लेड विच्छेदन के लिए उपयोग किया जाता है.
- अलग निर्धारित विंदुक बंदूक, 10 मिलीलीटर हस्तांतरण pipettes, और पृथक्करण के लिए 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी (बी फाल्कन 352340).
- कई विच्छेदन के लिए 10 सेमी संस्कृति (बी) बर्तन, हदबंदी के लिए 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों (बी), ऊतक भंडारण और ठंड कोशिकाओं के लिए जमे हुए शीशियों (बी) के लिए 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों अलग सेट.
2. मानव भ्रूण के मस्तिष्क से मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अलग
- भ्रूण की समाप्ति के तुरंत बाद व्यवहार्य ऊतक की फसल काटने वाले प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. वैकल्पिक प्रक्रियाओं के लिए, नमूने प्राप्त करने के समय अग्रिम में व्यवस्था की जा इतनी के रूप में भ्रूण की मृत्यु के बाद समय को कम करने के लिए कर सकते हैं. गर्भाधान के उत्पादों के 2 घंटे बाद की प्रक्रिया के भीतर काटा जाता है, लेकिन आदर्श मिनट के भीतर वैकल्पिक प्रक्रियाओं पर प्राप्त किया जा सकता है. भ्रूण के ऊतकों अक्सर खंडित कर रहे हैं. हालांकि, सामान्य में मस्तिष्क का एक महत्वपूर्ण भाग के दृश्य पहचान के लिए बरकरार है. Gestational उम्र (GA) की सीमाएं वैधानिक कानून द्वारा निर्धारित कर रहे हैं, लेकिन 18-22 GA सप्ताह के बीच इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया.
- भ्रूण मस्तिष्क एक 10 मिलीलीटर पेट्री ठंडा पीटा DMEM/F12 समाधान युक्त पकवान में रखा गया है. संरचनात्मक स्थलों द्वारा प्रांतस्था के विभिन्न भागों को पहचानें. ललाट और parieto - पश्चकपाल cortices के लिए सीमाएँ केंद्रीय परिखा और Sylvian विदर के extrapolated चौराहे से उन्मुख होते हैं. ललाट प्रांतस्था केंद्रीय परिखा के पूर्वकाल से ऊतक और सर्जिकल ब्लेड के साथ Sylvian विदर की सीमा के साथ काटना, वेंट्रिकल बरकरार और undamaged रखने के लिए सुनिश्चित करें.
- ललाट प्रांतस्था के अलग ब्लॉक से किसी भी अवशिष्ट रक्त और meninges निकालें. यदि नमूना पर्याप्त गुणवत्ता के है, यह विभिन्न प्रयोजनों के लिए कई छोटे नमूने में ब्लॉक काटना के लिए आदर्श है: वर्गों (4% paraformaldehyde में तय, पीएफए) और / प्रोटीन mRNA assays (तेजी से -80 डिग्री सेल्सियस में जमे हुए).
- एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब चयनित मस्तिष्क ब्लॉक स्थानांतरण, और ऊतक की मात्रा के बारे में 3 बार में ठंडा पीटा DMEM/F12 समाधान जोड़ने. धीरे यांत्रिक pipetting द्वारा एक 10 मिलीलीटर हस्तांतरण विंदुक के साथ ऊतकों को अलग कर देना जब तक सभी ऊतकों खंडित हो जाता है (आमतौर पर 20-30 बार), और फिर एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी (बी फाल्कन 352340) के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर करने के लिए एक या निकट एकल कक्ष प्राप्त निलंबन.
- 2000 rpm और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, 10 मिलीलीटर ताजा गर्म संस्कृति मध्यम (स्टेम प्रो एनएससी SFM) में सेल गोली resuspend, और एक hemocytometer साथ सेल संख्या गिनती.
- प्रत्येक 25 सेमी 2 संस्कृति बोतल में 5 मिलीलीटर गर्म संस्कृति के माध्यम जोड़ें, और प्रत्येक फ्लास्क 2x10 6 कोशिकाओं को हस्तांतरण . संस्कृतियों 37 एक ° सी / 5% विश्लेषण से पहले 1 सप्ताह के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखा जाता है. आगे संस्कृतियों या प्रयोगों के लिए एक सप्ताह में एक बार आधे मध्यम बदलें.
3. तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के आगे लक्षण वर्णन या experimentations के लिए Manipulaton
- Neurospheres आमतौर पर सिफारिश एनएससी व्यास संस्कृति शर्तों के साथ 200 और 400 सुक्ष्ममापी के बीच लेकर के तहत 1 से 2 सप्ताह में फार्म. इस चरण में Neurospheres 0.2 छ / एल EDTA कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त हैंक्स मध्यम (हैंक्स) में 37 ° C के साथ 15 मिनट के लिए अलग करने के लिए एकल कक्षों प्राप्त किया जा सकता है. कक्ष निलंबन 2000 rpm, ताजा हैंक्स में rinsed पर घूमती हैं, और subculture के लिए गर्म संस्कृति के माध्यम में replated.
- भेदभाव आरंभ करने के लिए, अलग कोशिकाओं poly-D-lysine/laminin 1 लेपित coverslips पर coverslip प्रति 1x10 5 कोशिकाओं (24mmX24mm) के घनत्व पर चढ़ाया जाता है. Oligodendrocyte भेदभाव DMEM/F12 पीटा (Invitrogen, मुख्य, एमडी) दो B27% (50X, Invitrogen, मुख्य, एमडी) 10 एनजी / मिलीलीटर bFGF 100 श एनजी / एमएल + 10ng/ml PDGF-ए.ए. में कोशिकाओं को बनाए रखने के द्वारा हासिल की है 2days, तो वृद्धि कारकों के बिना एक और 5 दिनों के लिए एक ही माध्यम से स्विचन. Neuronal भेदभाव को बनाए रखने की कोशिकाओं द्वारा पीटकर में हासिल की है 7 दिनों के लिए DMEM/F12 2% B27 (50X). Astrocyte भेदभाव संवर्धन कोशिकाओं के द्वारा एक सप्ताह के लिए DMEM/F12 1% FBS पीटा में किया जाता है.
- तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के जीन के साथ अभिकर्मक preformed neurospheres से अलग कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है. यहाँ, हम electroporation द्वारा EGFP-C1 साथ ट्रांसफ़ेक्ट तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से पता चला. EGFP-C1 निर्माण की electroporation माउस तंत्रिका स्टेम सेल के लिए AMAXA Nucleofector किट का उपयोग किया गया था (VPG1004 AMAXA Nucleofector (Lonza AAD-1001) डिवाइस कंपनी अनुदेश निम्नलिखित है, के साथ). संक्षेप में, 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के साथ 5 μg डीएनए 100 μl अभिकर्मक मध्यम के साथ मिलाया गया है, और नाड़ी electroporation के बाद, कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में आगे संस्कृति के लिए मध्यम बनाए रखने resuspended थे. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के भेदभाव neurospheres electroporation बाद 3-4 दिनों के पृथक्करण के साथ ही कदम 3.2 में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन प्रोसेस किया गया.
4. बर्फ़ीली तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और subcultures
- Dissociated सेल निलंबन centrifuged 1x10 7 कोशिकाओं शीशी / / मिलीलीटर की एक एकाग्रता के साथ ठंड मध्यम में resuspended. -20 डिग्री सेल्सियस, -80 में धीरे धीरे कोशिकाओं फ्रीज ° सी तो लंबे समय से भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण.
- कोशिकाओं को तेजी से 37 के साथ thawed हैं डिग्री सेल्सियस DMEM/F12 10% एक धोने के लिए सीरम गर्म पानी के स्नान और में resuspended, ठंड मध्यम निकालने centrifuged, और गरम संस्कृति माध्यम में resuspended.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
18 सप्ताह gestational उम्र में एक सामान्य भ्रूण से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं वर्णित विधियों और neurospheres दौर, चिकनी बॉर्डर्स और काफी समरूप आकार (Fig.2A) के साथ एक सप्ताह के बाद देखा जा सकता है है निम्नलिखित सुसंस्कृत थे. ये neurospheres EGFP-C1 या अन्य constructs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (Fig.2B) के तहत पीछा किया. स्थापित neurospheres तो EDTA के साथ अलग और लेपित coverslips छितरी पर कोशिकाओं के रूप में चढ़ाया गया. संबंधित प्रोटोकॉल के तहत विभेदित कोशिकाओं parafamaldehyde 4% के साथ तय किया गया है, और अलग अलग सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों के साथ दाग. Multipotentiality न्यूरॉन्स का संकेत (Fig2C, विकास, rhodamine) astrocytes (Fig2E, एफ, rhodamine) मार्करों और oligodendrocytes (Fig2G, एच, rhodamine) की अभिव्यक्ति के साथ मनाया जाता है. आया EGFP की electroporation नहीं कोशिकाओं को भी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया गया और अलग अलग सेल विशिष्ट मार्करों के साथ दाग. Multipotentiality न्यूरॉन्स का संकेत (Fig3A, बी, fluoroscein) astrocytes (Fig3C rhodamine, और Fig3D, fluoroscein) मार्करों और oligodendrocytes (Fig3E, एफ, rhodamine) की अभिव्यक्ति के साथ मनाया जाता है.
चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध त्याग मानव भ्रूण के मस्तिष्क से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अलग.
चित्रा 2 undifferentiated और विभेदित मानव तंत्रिका कोशिकाओं इन विट्रो में propogated. (ए) Neurospheres चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत दिखाया जाता है चिकनी, गोल सीमाओं और 1 से अधिक सप्ताह के लिए संस्कृति के बाद तेजी से विकास का प्रदर्शन. (बी) विभिन्न plasmids और constructs का परिचय अभिकर्मक के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. EGFP-C1 अभिकर्मक के बाद तीन दिन, एकाधिक कोशिकाओं हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में fluoroscein immunostaining और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत देखा की अभिव्यक्ति दिखाओ. EGFP-C1 ट्रांसफ़ेक्ट neurospheres (सी, डी) न्यूरॉन्स, astrocytes (ई, एफ) और oligodendrocytes (जी, एच) में अलग अलग परिस्थितियों में अलग और भेदभाव कर रहे हैं और प्रतिदीप्ति rhodamine के अंतर्गत देखा. समवर्ती, ट्रांसफ़ेक्ट EGFP सकारात्मक कोशिकाओं fluoroscein प्रतिदीप्ति के अंतर्गत दिखाए जाते हैं. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (सफेद तीर सिर) untransfected कोशिकाओं (सफेद तीर) से अप्रभेद्य हैं. सेल नाभिक Hoechst33342 के साथ दाग रहे हैं. स्केल सलाखों के लिए एक 200 सुक्ष्ममापी, बी के लिए 100 सुक्ष्ममापी और दर्पण के लिए 25 सुक्ष्ममापी हैं.
चित्रा 3. अभिकर्मक बिना Neurospheres (ए, बी, fluoroscein) न्यूरॉन्स, astrocytes (सी, rhodamine, विकास, fluoroscein) और oligodendrocytes (ई, एफ, rhodamine) में अलग अलग परिस्थितियों में अलग और भेदभाव कर रहे हैं. सेल नाभिक Hoechst33342 के साथ दाग रहे हैं. स्केल सलाखों वायुसेना के लिए 25 सुक्ष्ममापी हैं.
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Discussion
संस्कृति ताजा ऊतक और मानव कोशिका लाइनों के उत्पादन की ओर विभिन्न दृष्टिकोण हैं. ऐतिहासिक, ताजा ऊतक काटा गया है और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न तुरंत सुसंस्कृत. लेकिन यह दृष्टिकोण स्पष्ट रूप से नमूने है कि मानव के नमूने के लिए मामले में, आमतौर पर काफी छोटा प्राप्त जो किया जा सकता है की संख्या से सीमित है. गड़बड़ी की कम से कम डिग्री को देखते हुए, हौसले सुसंस्कृत तंत्रिका कोशिकाओं विस्तारित संवर्धन से संभावित कलाकृतियों को सीमित द्वारा प्रयोगात्मक सबसे विश्वसनीय प्रणाली प्रदान करते हैं. सीमित आपूर्ति मानव कोशिका लाइनों है कि विभिन्न ओंकोजीन 12, 13 की प्रविष्टि के माध्यम से अमर हो गया था पैदा करने का एक दूसरा दृष्टिकोण करने के लिए नेतृत्व. इस दृष्टिकोण के लिए चिंता की संभावना है कि इन कोशिकाओं के oncogenic हेरफेर सेल गुण बदल जाएगा में निहित है. इसके अतिरिक्त, मानव कोशिका लाइनों पैदा करने के लिए तर्क का हिस्सा प्रत्यारोपण और विभिन्न मानव विकारों के उपचार के लिए संभावित था. अमर सेल लाइनों कैंसर के विकास के जोखिम की संभावना अधिक होती जा सकता है. इन सेल लाइनों को लाभ लाइनों की एकरूपता, उनके विभिन्न neuronal और glial मस्तिष्क के एक क्षेत्र में निहित phenotypes को अपनाने की क्षमता है, और संस्कृतियों के बड़ी संख्या में पैदा की आसानी है. संभावित oncogenic सीमाओं को पार करने के लिए, विभिन्न दृष्टिकोण संवर्धन प्राथमिक मानव तंत्रिका स्टेम सेल के लिए इस्तेमाल किया गया है. अधिकांश तरीकों EGF और कक्षों की bFGF हेरफेर पर आधारित हैं, आसंजन या निलंबन संस्कृति तकनीक के साथ. इन अलग अलग दृष्टिकोण में 14 एनएससी के विभिन्न purities परिणाम. Svendsen एट अल. सेल सेल को बनाए रखा संपर्क (15), जो एक कम समय में एनएससी के अमीर उत्पादन दे सकते हैं के साथ बनाई neurospheres के अनुभाग द्वारा एनएससी संस्कृति की एक विधि की सूचना दी. हालांकि, इन neurospheres के साथ oligodendrocyte बाद मार्ग पर प्राप्त नहीं किया जा सकता है. EGF और bFGF के साथ समृद्ध neurospheres भी इन विट्रो में 14 transcriptional और सेलुलर phenotypes बदल सकते हैं . जल्दी बीतने संस्कृतियों के प्रयोग संस्कृतियों की एक बड़ी संख्या के लिए की जरूरत है और संस्कृति artifact के परिचय के लिए कम से कम चिंता के बीच एक उचित समझौता प्रदान करता है. सबसे हाल ही में अग्रिम स्टेम सेल गुणों को बनाए रखने के लिए आवश्यक जीनों का एक सबसेट के लिए मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी में बनाया गया है. आईपीएस कोशिकाओं मानव कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं है कि मानव शरीर शामिल के सभी विभिन्न प्रकार उत्पन्न करने की क्षमता प्रदान करने का लाभ है. वर्तमान में, यह पिछले लाभ भी इस मॉडल प्रणाली कम है कि के लिए एक विशेष सेल प्रकार (यानी अग्रमस्तिष्क न्यूरॉन्स) कोशिकाओं को बदलने के संकेत तंत्र ज्ञात नहीं कर रहे हैं में अपील करता है.
वर्तमान मानव एनएससी की पीढ़ी के लिए वर्णित विधियों अन्य प्रकाशित दृष्टिकोण से कुछ मामूली बदलाव प्रदान करते हैं. अधिकांश पिछले विधियों सेल पृथक्करण (trypsin या papain) के विभिन्न enzymatic या रासायनिक मतलब का उपयोग भ्रूण प्रांतस्था से एनएससी को अलग कर देना. सामान्य में, ऊतक की बड़ी मात्रा में दिया है, हम ठीक सेल निस्पंदन के साथ कोमल यांत्रिक trituration का उपयोग करने के लिए है जो कम से कम हेरफेर आया है व्यवहार्य एकल कक्षों प्राप्त. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण ऊतक फसल से ऊतक संवर्धन / भंडारण, जो मानव नमूनों के लिए महत्वपूर्ण है करने के लिए समय कम से कम.
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे त्याग ललाट cortical 7,9,10,11 ऊतकों से मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए . neurospheres अलग करने के लिए पद्धति मानव और चूहों के बीच थोड़ा अनुकूलित मानव ऊतकों के नमूनों में एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए यहाँ वर्णित दृष्टिकोण के साथ बदलता रहता है. मानव ऊतक के उपयोग में कई विचार कर रहे हैं. और सबसे पहले भ्रूण के निधन के बाद समय सीमित है सेल हदबंदी और कटाई की शुरुआत करने के लिए पहले. 4 में वैकल्पिक गर्भपात और बनाए रखने के नमूने के पूर्व समयबद्धन द्वारा इस समस्या को कम किया जा सकता डिग्री सेल्सियस दूसरा, यह महत्वपूर्ण है हदबंदी के लिए cortical ऊतक के स्थलों की पहचान करने की कोशिश. इस छोर की ओर, यह निष्फल प्रक्रिया प्रदर्शन चिकित्सक मस्तिष्क अखंडता बनाए रखने संभव है जब प्रयास करने के लिए सूचित करने के लिए उपयोगी है. तीसरा, यह एहसास है कि 18-22 सप्ताह में भी मानव भ्रूण के मस्तिष्क के पैमाने तक अधिक महत्वपूर्ण है, इसलिए भी एक वयस्क माउस या चूहा है कि और, हदबंदी, निस्पंदन, प्रदर्शन और प्रणाली के साथ एक बड़ा throughput के धोने की जरूरत (यानी बड़े प्लास्टिक के बर्तन, 10 मिलीलीटर प्लास्टिक pipets बनाम गिलास पॉलिश pipets, कई समानांतर में संसाधित नमूनों). चौथा, कोशिकाओं यंत्रवत् अलग कर रहे हैं और यह सुनिश्चित करें कि सभी ऊतक टुकड़े गए हैं करने के लिए आवश्यक नहीं है. बल्कि यह trituration के रूप में संभव के रूप में ज्यादा समझ है कि निस्पंदन संवर्धन के लिए बड़ा नमूना से अवांछित बड़ा ऊतक टुकड़े और अलग पर्याप्त व्यक्ति एनएससी निकाल देंगे के साथ, कम से कम बेहतर है. चौथा, चुना अभिकर्मकों मानव neurospheres के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. अंत में ओ,पूर्वोत्तर के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं को परेशान नहीं की कोशिश के बाद वे मढ़वाया हैं, इतनी के रूप में एकत्रीकरण कम करने के लिए करना चाहिए.
एक बार मानव तंत्रिका स्टेम सेल clonal क्षेत्रों का गठन किया है, वे एकल कक्षों में अलग रूप में ऊपर वर्णित कर सकते हैं और पता लगाने आत्म नवीकरण क्षमताओं के लिए passaged या अलग अलग सेल प्रकार वृद्धि कारक है और / या प्रोटीन के विभिन्न संयोजनों का उपयोग में विभेदित.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
HD054347 और VLS NS063997-01: इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया था. साम्राज्य राज्य स्टेम सेल फंड द्वारा नई स्वास्थ्य अनुबंध # C024324 VLS के न्यूयॉर्क राज्य विभाग के माध्यम से यह काम भी भाग में समर्थित किया गया था. यहाँ व्यक्त राय से पूरी तरह से कर रहे हैं उन लेखक की और एम्पायर स्टेट स्टेम सेल बोर्ड, नई स्वास्थ्य के न्यूयॉर्क राज्य विभाग, या न्यूयॉर्क के राज्य के उन लोगों को प्रतिबिंबित जरूरी नहीं. VLS एक डोरिस ड्यूक नैदानिक वैज्ञानिक विकास पुरस्कार प्राप्तकर्ता है. हम भी प्रोफेसर तीमुथियुस Vartanian विरोधी O1, विरोधी O4 एंटीबॉडी के अपने उपहार के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D Systems | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D Systems | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell Signaling Technology | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | Dako | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| * Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA | |||
References
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