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Neuroscience

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

doi: 10.3791/2681 Published: May 25, 2011

Summary

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

Abstract

신경 줄기 세포 (NSCs)은 대뇌 피질 판의 개발 중에 심실 영역 neuroepithelium 함께 거주. 이러한 초기 progenitors 궁극적으로 중급 progenitors을 일으키다 이상, 대뇌 피질을 형성 다양한의 연결 및 glial 세포 subtypes. 폐기 정상 태아 조직에서 인간 NSCs을 (그래서 neurospheres라고도 함) 생성 및 확장하는 능력은 바로 정상적인 인간 NSC 개발 1-5의 기능 측면을 연구하기 위해있는 수단을 제공합니다. 이 접근법은 또한이를 통해 조상의 증식, 이주 및 차별 6-9를 변경 질병 프로세스를 식별할 수있는 기회를 affording, 알려진 신경 질환에서 NSCs의 생성 방향으로 이동하실 수 있습니다. 우리는 빠른 속도로 알츠하이머 질병 표현형 10,11에 기여할 수 있습니다 인간의 다운 증후군의 NSCs의 병리 학적 메커니즘을 식별에 초점을했습니다. 나도 생체내에이나 체외 마우스 모델은 인간의 염색체 21에 위치한 유전자의 동일한 레퍼토리를 복제할 수 없습니다.

여기 중단 인간의 태아 cortices의 증후군의 NSCs 다운 격리와 문화에서 성장하는 간단하고 신뢰할 수있는 메서드를 사용합니다. 방법론이 제한 해부의 명소, 셀 정렬은 도금 인간 NSCs의 passaging과 조직, 절개를 수확의 특정 측면을 제공합니다. 우리는 또한 더 선택적 세포 subtypes에 인간 NSCs의 차별을 유도하는 몇 가지 기본적인 프로토콜을 제공합니다.

Protocol

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1. 해부 및 신경 줄기 세포 문화의 유지 관리를위한 솔루션 및 자료 준비

  1. 미리 100ml 해부 매체 (넉아웃 DMEM/F12, Invitogen)을 준비하고 냉동.
  2. Prepare100 ML 문화 매체 (줄기 프로 NSC SFM, Invitrogen)와 37 ° 보관 물을 욕조에 C.
  3. 세포의 장기 cryopreservation에 대한 셀 - 냉동 매체 (녹아웃 DMEM/F12 +10 % FBS + 5% DMSO)를 준비합니다.
  4. 원하는 경우, 조직 고정을위한 4 % paraformaldehyde (PFA)를 준비합니다.
  5. 핸들과 멸균, autoclaved 포셉와 메스 블레이드는 절개에 사용됩니다.
  6. 피펫 총 10 ML 전송 pipettes, 그리고 해리 40 μm의 셀 스트레이너 (BD 팰컨 352,340)를 별도로 설정합니다.
  7. 해부 여러 10cm 문화 요리 (BD), 해리 50 ML의 원심 분리기 튜브 (BD), 냉동 세포 조직 보관 및 냉동 튜브 (BD)에 대한 1.5 ML 원심 분리기 튜브를 따로 설정합니다.

2. 인간 태아 뇌에서 인간 신경 줄기 세포를 분리

  1. 즉시 태아의 종료 후 가능한 조직의 적출하는 것은 절차의 성공에 필수적인 요소입니다. 선택 절차를 보려면 샘플을 얻기 위해 타이밍은 태아의 죽음 이후 시간을 최소화하기 위해 않도록 사전에 준비하실 수 있습니다. 개념의 제품은 2 시간 게시 절차 내에 수확하지만, 이상 분 이내에 선택 절차에 형성될 수 있습니다. 태아 조직은 종종 조각입니다. 그러나, 일반적으로 두뇌의 상당 부분은 시각적인 신원 확인을 위해 그대로 유지됩니다. 임신 성 연령 (GA)의 제한은 법정 법률에 의해 결정되지만 18-22주 GA 사이에이 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다.
  2. 태아 두뇌는 얼음처럼 차가운 마네 DMEM/F12 솔루션을 포함하는 10 ML 페트리 접시에 배치됩니다. 해부 학적 경계표에 의해 피질의 다른 부분을 식별합니다. 전두엽과 parieto - 뒤통수 cortices에 대한 경계는 중앙 고랑과 실비안 균열 (fissure)의 추정 교차로에서 지향하고 있습니다. 뇌실은 그대로 유지하고 손상을 확인하고, 중앙 고랑에 앞쪽에 전두엽 피질로부터 수술 블레이드와 실비안 균열 (fissure)의 경계를 따라 조직을 해부하다.
  3. 전두엽 피질의 분리 블록에서 잔여 혈액과 meninges를 제​​거합니다. 샘플이 충분 품질 경우, 다양한 목적을 위해 여러 개의 작은 샘플로 블록을 해부하다에 이상적입니다 : 섹션 (PFA, 4 % paraformaldehyde에 고정) 및 단백질 / mRNA assays (빠른 -80 ° C에 냉동).
  4. 50 ML의 원심 관에 선택한 뇌 블록을 전송하고, 조직의 볼륨의 약 3 시간에 얼음처럼 차가운 마네 DMEM/F12 솔루션을 추가합니다. 부드럽게 10 ML 전송 피펫과 기계 pipetting하여 조직을 떼어 놓다 모든 조직 때까지 (일반적으로 20-30 회) 조각되고, 그리고 단일 또는 가까운 단일 세포를 얻는 40 μm의 셀 스트레이너 (BD 팰컨 352340)를 통해 세포를 필터링 정지.
  5. 5 분 2000 RPM과 실온에서 세포 현탁액을 원심 분리기, 10 ML 신선한 따뜻한 문화 매체 (줄기 프로 NSC SFM)의 세포 펠렛을 resuspend하고, hemocytometer로 휴대폰 번호를 계산합니다.
  6. 각 25cm 문화 flasks에 5 ML 따뜻한 문화 매체를 추가하고 각 플라스크에 2X10 6 세포를 전송합니다. 문화는 37 유지 ° 분석하기 전에 1 주일 C / 5% CO 2 배양기. 자세한 문화 또는 실험 동안 일주일에 한 번씩은 절반 매체를 변경합니다.

3. 자세한 특성화 또는 experimentations에 대한 신경 줄기 세포의 Manipulaton

  1. Neurospheres은 보통 200 400 μm의 사이에 이르기까지 NSC 직경과 추천 문화 조건 1-2주 양식. 이 단계에서 Neurospheres 단일 세포를 얻는 15 분 37 칼슘, 마그네슘 무료 행크스 매체 (행크스)에서 0.2 g / L EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ° C로 dissociated 수 있습니다. 세포 현탁액은 신선한 행크스에 씻어서 2,000 RPM에서 냈지, 그리고 subculture에 대한 따뜻한 문화 매체 replated 있습니다.
  2. 차별을 시작하려면, dissociated 전지 coverslip 당 1X10 5 셀 (24mmX24mm)의 밀도에 poly-D-lysine/laminin 한 코팅 coverslips에 도금입니다. Oligodendrocyte 차별은을 위해 마네 DMEM/F12 (Invitrogen, 메인, MD) 2% B27 (50X, Invitrogen, 메인, MD) 10 NG / ML bFGF 100 NG / ML 쉬이잇 + 10ng/ml PDGF - AA의 세포를 유지하여 이루어집니다 이일은 다음 다른 오일에 대한 성장 요인없이 동일한 매체로 전환. 의 연결을 분화는 7 일 동안 마네의 유지 세포 DMEM/F12 2퍼센트 B27 (50X)를 얻을 수 있습니다. Astrocyte 차별화는 일주일 동안 마네 DMEM/F12 1% FBS 안에 culturing 세포에 의해 이루어집니다.
  3. 유전자와 신경 줄기 세포의 Transfection은 preformed neurospheres에서 dissociated 세포로 할 수 있습니다. 여기, 우리는 electroporation에 의해 EGFP - C1과 transfected 신경 줄기 세포를 보여주었다. EGFP - C1 구조의 electroporation은 (마우스 신경 줄기 세포에 대한 AMAXA Nucleofector 키트를 사용하여 수행되었습니다 VPG -회사의 지시 아래 AMAXA Nucleofector 장치 (Lonza AAD - 1001)과 1004). 즉, 1 X 10 6 세포를 5 μg의 DNA는 100 μl transfection 매체와 혼합되었고, 펄스 electroporation 후, 세포는 더 이상 문화의 중간을 유지하는 신경 줄기 세포에서 resuspended되었습니다. transfected 세포의 분화는 단계 3.2에서 설명한 동일한 절차에 따라 electroporation 후 neurospheres 3~4일의 분리와 처리되었습니다.

4. 냉동 신경 줄기 세포와 비주류

  1. Dissociated 세포 suspensions는 1X10 7 셀 / 유리병 / ML의 농도와 centrifuged 및 냉동 매체 resuspended 있습니다. 천천히 -20 ° C, -80에서 세포를 동결 ° C 후 오랫동안 저장을위한 액체 질소로 전송할 수 있습니다.
  2. 세포는 빠른 37와 해동 아르 ° C 물 목욕 및 resuspended은 세척을위한 혈청 DMEM/F12 +10 % 따뜻하게 냉동 매체를 제거하는 centrifuged 및 예열 문화 매체에 resuspended.

5. 대표 결과 :

18주 임신 성 나이에 정상적인 태아의 신경 줄기 세포는 설명 방법과 neurospheres가 둥근, 부드러운 테두리와 비교적 균일한 크기 (Fig.2A)와 일주일 뒤에 볼 수있는 다음과 같은 교양되었습니다. 이러한 neurospheres은 EGFP - C1이나 기타 구성과 transfected 및 형광 현미경 (Fig.2B)에 따라 다음 수 있습니다. 설립 neurospheres 다음 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 dissociated 및 코팅 coverslips에 분산된 세포로 도금했다. 각각의 프로토콜에 따라 차별화된 세포는 4 % parafamaldehyde로 고정하고, 다른 세포 유형의 특정 마커와 스테인드되었습니다. Multipotentiality는 (Fig2E, F, rhodamine) astrocytes (Fig2C, D, rhodamine) 뉴런을 나타내는 마커 및 oligodendrocytes (Fig2G, H, rhodamine)의 표현과 관찰이다. EGFP의 electroporation 공사를하지 세포는 다른 세포 유형으로 차별하고 다른 셀에 특정 마커와 스테인드되었습니다. Multipotentiality는 (Fig3C, rhodamine 및 Fig3D, fluoroscein) astrocytes (Fig3A, B, fluoroscein) 뉴런을 나타내는 마커 및 oligodendrocytes (Fig3E, F, rhodamine)의 표현과 관찰이다.

그림 1
그림 1. 폐기 인간 태아의 두뇌에서 신경 줄기 세포를 분리하는 실험 절차의 도식

그림 2
그림 2. 체외에서 propogated Undifferentiated와 차별화된 인간의 신경 세포. (A) Neurospheres은 부드럽고 둥근 테두리 1 이상의 주일 동안 문화 이후 급속한 성장을 보여 위상 콘트라스트 현미경 아래에 표시됩니다. (B) 다양한 plasmids과 구성의 소개 transfection을 통해 형성될 수 있습니다. EGFP - C1의 transfection 다음과 같은 세 가지 일, 여러 세포는 fluoroscein의 immunostaining 및 형광 현미경 하에서 본 녹색 형광 단백질의 표현을 보여줍니다. EGFP - C1 transfected neurospheres은 뉴런 (C, D), astrocytes (E, F)와 oligodendrocytes (G, H)로 서로 다른 조건에서 dissociated하고 차별하고 rhodamine의 형광 아래에서 보았다. 동시에, transfected EGFP 긍정적인 세포 fluoroscein 형광 아래 표시됩니다. Transfected 세포 (흰색 화살표 머리) untransfected 셀 (흰색 화살표)에서 구별할 수 있습니다. 세포 핵은 Hoechst33342 물들일 수 있습니다. 스케일 바는 200 μm의, B 100 μm의 및 CH 25 μm의 수 있습니다.

그림 3
그림 3. transfection없이 Neurospheres은 뉴런 (A, B, fluoroscein), astrocytes (C, rhodamine, D, fluoroscein)와 oligodendrocytes (E, F, rhodamine)으로 서로 다른 조건에서 dissociated와 차별됩니다. 세포 핵은 Hoechst33342 물들일 수 있습니다. 스케일 바 AF 25 μm의 수 있습니다.

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Discussion

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문화 신선한 조직 및 생산 인간의 세포 라인에 대한 다양한 접근 방법이 있습니다. 역사적으로, 신선한 조직은 수확되었고 중추 신경계의 여러 세포 유형을 생성하는 즉시 양식. 이 접근법은 그러나 명확하게 얻은 인간 샘플의 경우에는 일반적으로 매우 작은 수있는 샘플의 수에 따라 제한됩니다. 조작의 최소한의 정도로봤을 때, 갓 교양 신경 세포가 확장 culturing에서 잠재적인 유물을 제한함으로써 가장 안정적인 실험 시스템을 제공합니다. 제한된 공급 다양한 oncogenes 12, 13의 삽입을 통해 영원히 있었다 인간의 세포 라인을 생성하는 두 번째 접근되었다. 이 접근법에 대한 우려는 이러한 세포의 종양 발생 조작은 셀 속성을 변경 것이라는 가능성에 누워. 또한, 인간의 세포 라인을 생성하기위한 근거의 일부는 다양한 인간의 장애의 이식 치료에 대한 가능성이되었습니다. 불후의 세포 라인은 암 성장 위험 predispose 수 있습니다. 이러한 세포 라인에 대한 이점은 라인의 균일, 두뇌의 지역 고유의 다양한의 연결 및 glial phenotypes을 채택하는 능력, 그리고 문화의 다수를 생성하는 편리합니다. 잠재적인 종양 발생 한계를 극복하기 위해 다양한 방법이 culturing 기본 인간의 신경 줄기 세포에 사용되었습니다. 대부분의 방법은 접착 또는 서스펜션 문화 기술과 함께, EGF 및 세포의 bFGF 조작을 기반으로합니다. 이러한 다양한 접근 방법 NSC 14 가지 purities의 결과. 스벤센 외. 짧은 시간에 NSC의 풍부한 생산을 줄 수 유지 세포 세포 연락처 (15)와 함께 결성 neurospheres 섹션으로 NSC 문화의 방법을보고했다. 그러나, oligodendrocyte 나중 구절에서 이러한 neurospheres 함께 얻을 수 없습니다. EGF와 bFGF와 풍부한 neurospheres 또한 체외 14 transcriptional 및 세포 phenotypes을 변경할 수 있습니다. 조기 통과 문화의 사용은 문화의 큰 숫자에 대한 필요성과 문화 유물의 도입에 대한 최소한 우려 사이에 합리적인 타협을 제공합니다. 최근 진보는 줄기 세포 특성을 유지하는 데 필요한 유전자의 일부의 강제 표현에 의해 유도된 pluripotent 줄기 세포의 세대되었습니다. IPS 세포는 큰 인간 세포의 수량뿐만 아니라 인체를 구성하는 세포의 모든 다른 유형을 생성하는 잠재력을 제공하는 장점이 있습니다. 현재,이 마지막 장점은 또한 특정 세포 유형 (예 : 뉴런 forebrain)에 세포를 변환하는 신호 메커니즘은 알려져 있지되는이 모델은 시스템을 덜 호소합니다.

인간 NSCs의 생성에 대한 설명 현재의 방법은 다른 출판 접근으로부터 약간의 변형을 제공합니다. 대부분의 이전 방법은 태아 피질에서 NSC을 떼어 놓다하는 세포 분리 (트립신 또는 papain)의 여러 효소 또는 화학적 수단을 사용합니다. 일반적으로 조직의 대량 감안할 때, 우리는 최소한의 조작을받은 가능한 단일 세포를 얻기 위해 미세 세포 여과와 부드러운 기계적 분쇄를 사용합니다. 또한, 이러한 방식은 조직 수확에서 인간의 샘플에 대한 중요 조직 culturing / 스토리지, 시간을 최소화합니다.

이 프로토콜은 폐기 전두엽 피질 조직을 7,9,10,11에서 인간 신경 줄기 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. neurospheres를 격리 시킨것에 대한 방법론은 인간의 조직 샘플에서 단일 셀 suspensions를위한 최적 여기에 설명된 방식으로, 인간과 생쥐 사이에 약간 다릅니다. 인체 조직의 사용 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 첫 번째 그리고 대부분은 세포 분리 및 수확의 발병 이전에 태아 사망 후 시간을 제한합니다. 이 문제는 4 과목 낙태 및 유지 관리 시료의 사전 예약하여 해결할 수 있습니다 ° C. 둘째, 대뇌 피질의 조직 분리를위한 랜드마크를 파악하려고하는 것이 중요합니다. 이를 향해, ​​그것은 불완전 절차를 수행 의​​사가 가능한 경우 두뇌 무결성을 유지하려고 알려 유용합니다. 셋째, 그것도 18~22주에서 인간의 태아 두뇌의 규모가 훨씬 초과 것을 깨닫게하는 것이 중요합니다 따라서도 성인 마우스 또는 쥐의하고, 분리, 여과 및 큰 처리량 시스템으로 세탁을 수행하기 위해 필요 (큰 플라스틱 도자기, 10 ML 플라스틱 pipets 대 유리 광택 pipets, 병렬 처리 여러 샘플을 IE). 넷째, 세포가 기계적으로 dissociated 있으며, 그것은 모든 조직의 파편이 사라지고 있는지 확인하실 필요는 없습니다. 오히려 여과가 culturing에 대한 큰 예제에서 불필요한 큰 조직 파편과 별도의 충분한 개별 NSCs를 제거할 것이라는 이해와 함께, 가능한 한 가루약을 최소화하기 위해 바람직 그것을 것입니다. 넷째, 선택한 시약 인간 neurospheres에 최적화되어 있습니다. 마지막으로, ONE가 집계를 최소화하기 때문에, 그들은 도금 후 개별 세포를 방해하지 않도록 노력해야한다.

인간 신경 줄기 세포가 clonal 분야를 형성되면, 그들은 위에서 설명한대로 하나의 셀에 dissociated 수 있으며, 확인할 자기 갱신 기능을 passaged 또는 성장 요인 및 / 또는 단백질의 다른 조합을 사용하여 다른 세포 유형으로 차별화된 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

HD054347와 VLS에 NS063997 - 01 :이 작품은 국립 보건원에 의해 부분적으로 지원되었다. 이 작품은 또한 건강 계약 # C024324 VLS로의 뉴욕 국무부를 통해 엠파이어 스테이트 줄기 세포 기금에 의해 부분적으로 지원되었다. 의견 여기 표현은 전적으로 저자의 견해이며, 반드시 엠파이어 스테이트 줄기 세포위원회, 건강의 뉴욕 국무부, 또는 뉴욕주 분들을 반영하지 않습니다. VLS는 도리스 듀크 임상 과학자 발달 수상자입니다. 또한 안티 - O1, 안티 - O4 항체 자신의 선물을 교수 티모시 Vartanian 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KNOCKOUT DMEM/F12 Invitrogen 12660-012 Dissociation medium
Stem Pro NSC SFM Invitrogen A10509-01 Culture medium
Fetal Bovine Serum Invitrogen 10091-148 Frozen medium
Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) Invitrogen 14175-095 Dissociation medium
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Frozen medium
EDTA Sigma-Aldrich 431788 Dissociation medium
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Fixation solution
bFGF R&D Systems 234-FSE Differentiation medium
SHH R&D Systems 1845-SH Differentiation medium
PDGF-AA R&D Systems 221-AA Differentiation medium
B27 Invitrogen 17504-044 Differentiation medium
Mouse Anti-MAP2 Sigma-Aldrich M2320 1:200
Rabbit Anti-DCX Cell Signaling Technology 4604s 1:200
Rabbit Anti-GFAP Dako Z0334 1:200
Rabbit Anti-S100B Dako Z0311 1:200
Rabbit Anti-O1 gifts of Professor Timothy Vartanian* 1:50
Rabbit Anti-O4 Gifts of Professor Timothy Vartanian* 1:50
40μm cell strainer BD Biosciences 352340
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA

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References

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Lu, J., Delli-Bovi, L. C., Hecht, J., Folkerth, R., Sheen, V. L. Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue. J. Vis. Exp. (51), e2681, doi:10.3791/2681 (2011).More

Lu, J., Delli-Bovi, L. C., Hecht, J., Folkerth, R., Sheen, V. L. Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue. J. Vis. Exp. (51), e2681, doi:10.3791/2681 (2011).

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