Summary
Dit protocol laat zien hoe retrogradely label retinale ganglioncellen, en hoe nadien tot een oogzenuw crush om retinale ganglion cel overleving en apoptose te analyseren. Het is een experimenteel ziekte model voor verschillende typen van optische neuropathie, zoals glaucoom.
Abstract
Schade aan de oogzenuw kan leiden tot axonale degeneratie, gevolgd door een langzame dood van retinale ganglioncellen (RGC), wat resulteert in onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen. Voorbeelden van dergelijke ziekten bij de mens onder andere traumatische optische neuropathie en de oogzenuw degeneratie bij glaucoom. Het wordt gekenmerkt door typische veranderingen in de oogzenuw kop, vooruitstrevende optische zenuw degeneratie, en het verlies van retinale ganglioncellen, zo ongecontroleerd, wat leidt tot verlies van gezichtsvermogen en blindheid.
De oogzenuw verpletteren (ONC) letsel muis model is een belangrijk model voor de ziekte experimenteel traumatische optische neuropathie, glaucoom, etc. In dit model, de crush schade aan de oogzenuw leidt tot een geleidelijke retinale ganglioncellen apoptose. Deze ziekte model kan gebruikt worden om de algemene processen en mechanismen van neuronale dood en overleving, die essentieel is voor de ontwikkeling van therapeutische maatregelen te bestuderen. Daarnaast kunnen farmacologische en moleculaire benaderingen worden gebruikt in dit model te identificeren en testen van potentiële therapeutische reagentia voor verschillende soorten optische neuropathie behandelen.
Hier bieden wij een stap voor stap demonstratie van (I) Baseline retrograde etikettering van retinale ganglioncellen (RGC) op dag 1, (II) Optische zenuw crush op dag 4, (III) Oogst de retinae en analyseren RGC overleving na dag 11, en (IV) Representatieve resultaat.
Protocol
Alle apparatuur en reagentia die worden gebruikt zijn steriel. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite (ACUC) op het NEI / NIH (dierlijke studie protocol NEI-570), en werden uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen en regelgeving.
1. Baseline Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen (RGC) op dag 1
Het doel van deze procedure is om retrogradely label van de retinale ganglioncellen door het injecteren van een neuraal tracer kleurstof in de superieure colliculus van de muizen drie dagen voor de oogzenuw verpletteren letsel. De kleurstof wordt retrogradely worden genomen door de retinale ganglioncellen en biedt een marker voor de levenden RGC (figuur 1). Deze aanpak levert reproduceerbare etikettering van levensvatbare RGC met weinig variatie 1-5.
- Diep verdoven van de muis. Reinig de haren op de top van het hoofd. Plaats de muis in een kleine stereotaxische apparaat. Beschermende oinment wordt toegepast op beide ogen. Ontsmet het hoofd huid drie keer per behulp van een jodofoor en een 70% alcohol scrub.
- Maak een incisie in de huid van de schedel bloot te leggen, en houd het droog en schoon met behulp van 3% waterstofperoxide.
- Identificeer en markeer de bregma. Boor een gat boven de superieure colliculus op 2,9 mm achter de bregma en 0,5 mm lateraal van de middellijn van elk halfrond 7. Tijdens het boren van toepassing zoutoplossing om de plaats waar het gat is geboord naar secundair warmte letsel te voorkomen.
- Met behulp van een stereotaxische meetapparaat en een Hamilton spuit, injecteer de FluoroGold neurale tracer kleurstof (1 ul van 3% fluorochroom in een zoutoplossing) zeer langzaam in de superieure colliculus van elk halfrond op een diepte van 1,6 mm van de benige oppervlak van de hersenen.
- Suture de incisie site. Geef een subcutane injectie van buprenorfine voor analgesie.
- Beweeg de muis naar een warme en droge gebied en bewaken totdat het in staat is om een rechte houding te behouden en terug te sturen naar haar kooi. Voor de eerste drie dagen na de etikettering procedure, zijn systemische analgetica (bijv. buprenorfine) en actuele antibiotische zalf tweemaal daags en de muis wordt nauwlettend gevolgd.
2. Optic Nerve Crush letsel op dag 4
In deze procedure, zullen we een oogje blessure van toepassing op de oogzenuw een primaire schade aan de axonen (figuur 2), hetgeen zal leiden tot een geleidelijke dood van de retinale ganglioncellen veroorzaken.
- Drie dagen na de tracer kleurstof toepassing, de muis is diep verdoofd. Met behulp van een microscoop ontleden, is de conjunctiva van een oog ingesneden op ongeveer vier positie met behulp van een paar van de lente schaar.
- Voorzichtig buigen de orbitale spieren en leg ze opzij. Expose de witte oogzenuw op de uitgang van de oogbol. Let goed op dat er geen schade aan de bloedvaten.
- Met behulp van een paar cross-actie pincet, breng dan een verpletteren letsel aan de oogzenuw op ongeveer 2 mm van de oogbol voor ongeveer 3 seconden. Let goed op dat u de oogheelkundige schade slagader om het bloeden te veroorzaken.
- Na voltooiing van de blessure te verpletteren, is de incisie gehecht.
- Voordat de muis hersteld van anesthesie, geven een subcutane injectie van buprenorfine voor analgesie.
- Beweeg de muis naar een warme en droge gebied en bewaken, totdat het in staat is om een rechte houding te behouden en terug te keren naar haar kooi. Voor de eerste drie dagen na het verpletteren blessure procedure, zijn systemische analgetica (bijv. buprenorfine) en actuele antibiotische zalf tweemaal daags en de muis wordt nauwlettend gevolgd.
3. Oogst de retinae en analyseren RGC Survival Op Dag 11
Het doel van deze procedure is om te oogsten van de retinaeto analyseren retinale ganglion overleving van de cel.
- Op dag 11 (dag 7 na het ONC), wordt de muis gedood door de CO 2 infuus en cervicale dislocatie.
- Ogen zijn enucleated met behulp van een pincet door het toepassen van druk op de baan.
- De ogen zijn gefixeerd in 4% paraformaldehyde oplossing voor twee uur en gewassen in PBS drie keer. Ontleden het netvlies. De procedure van het netvlies dissectie is al eerder gepubliceerd door Jupiter in 2010 door Gustmann, S. et al.. Zes, en daarom zal hier niet worden beschreven.
- Beelden van de overlevende retinale ganglioncellen worden genomen met behulp van een fluorescerende microscoop in bepaalde regio's van het netvlies, en de retinale ganglion cel dichtheid kan worden geteld. Een vertegenwoordiger gevolg van de fluorescentie-gemerkte retinale ganglioncellen, met of zonder de oogzenuw te verpletteren letsel is weergegeven in figuur 3.
4. Representatieve resultaten:
Voor het analyseren van retinale ganglion cel overleving, zeven dagen na de oogzenuw verpletteren letsel, werden de retinae geoogst, vaste, afgeplatte en gemonteerd. Netvlies beelden werden gemaakt met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Vergeleken met de normale ongedeerd retina (links, Normaal), het aantal levensvatbare RGC (groen, retrogradely gelabeld door de FluoroGold neurale tracer kleurstof ingespoten in de superieure colliculus) is significant lager in de retinae met een oogzenuw verpletteren letsel (rechts, ONC) (figuur 3) .
Figuur 1. Baseline retrograde etikettering van retinale ganglioncellen
Om de levensvatbare retinale ganglioncellen tellen op verschillende tijdstippen na oogzenuw verpletteren letsel, worden de retinale ganglioncellen retrogradely bestempeld door het injecteren van een neuraal tracer kleurstof (groene kleur) in de superieure colliculus in de hersenen, drie dagen voor de oogzenuw ( rood) verpletteren letsel. Sinds de axonen van de retinale ganglioncellen bevinden zich in de superieure colliculus, zal de tracer kleurstof worden genomen door de RGC retrogradely en biedt een marker voor de levenden RGC.
Figuur 2. Optische zenuw crush
Om de status van retinale ganglion cel overleving te analyseren, is een crush toegepast op de oogzenuw (rood) een primaire schade aan de axonen veroorzaken. Dit zal leiden tot een langzame dood van de retinale ganglioncellen. Drie dagen na de tracer kleurstof (groen) injectie, de muis is verdoofd. Het bindvlies van een oog is ingesneden. Buigen van de baan spieren en leg ze opzij. Expose de oogzenuw op de uitgang van de oogbol. Breng een verpletteren schade aan de oogzenuw op ongeveer 2 mm van de oogbol voor ongeveer 3 seconden met een paar van de cross-action pincet.
Figuur 3. Fluorescentie-gelabelde retinale ganglioncellen, met of zonder de oogzenuw te verpletteren letsel
Voor het analyseren van retinale ganglion cel overleving, zeven dagen na de oogzenuw verpletteren letsel, werden de retinae geoogst, vaste, afgeplatte en gemonteerd. Netvlies beelden werden gemaakt met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Vergeleken met de gewonde normale netvlies (links, Normaal), het aantal levensvatbare RGC (groen, retrogradely gelabeld door de FluoroGold neurale tracer kleurstof ingespoten in de superieure colliculus) was significant lager in de retinae met een oogzenuw verpletteren letsel (rechts, ONC ) (Figuur 3). Schaal bar: 50 um
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De oogzenuw verpletteren letsel muis model is nuttig om het proces van het RGC dood en overleving te bestuderen. Dit model wordt ook vaak gebruikt om de effecten van verschillende reagentia en genen op RGC apoptose en overleving te onderzoeken. Een voordeel van dit model is dat het een hoge mate van reproduceerbaarheid met minimale variaties heeft.
Echter, is speciale zorg vereist in een aantal stappen in dit model. Eerste, bij het maken van de oogzenuw te verpletteren blessure, is het essentieel niet te veel geweld te gebruiken en niet te verpletteren te lang, omdat ze kunnen leiden tot schade aan de oogheelkundige slagader en dus na retinale ischemie. Daarnaast, wanneer het proberen om de oogzenuw bloot te leggen, dient men grote zorg niet op andere bloedvaten rond de muis oogschade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ons onderzoek wordt ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic apparatus | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Suture needle | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 88400 | |
| Gauze sponges | Office Depot | 674889 | |
| Fluorochrome | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Alcohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
References
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
