Summary
이 프로토콜은 망막 신경절 retrogradely 세포, 및 이후 망막 신경절 세포 생존과 apoptosis를 분석하기 위해서는 시신경의 호감 부상을하기 위해 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 그것은 녹내장을 포함하여 시신경 신경 장해의 종류에 대한 실험 질병 모델입니다.
Abstract
시신경 손상은 돌이킬 수없는 시력 상실 결과 망막 신경절 세포 (RGCs)의 점진적 죽음 뒤에, axonal 퇴보를 가져올 수 있습니다. 인간의 이러한 질병의 예는 외상 시신경 신경 장해 및 녹내장에서 시신경의 퇴행을 포함합니다. 이것은 시력 손실과 실명으로 이어지는 시신경의 머리에 전형적인 변화, 진보적인 시신경의 퇴행 및 망막 신경절 세포의 손실, 통제하는 경우,이 특징입니다.
시신경의 호감 (ONC) 부상 마우스 모델은 외상성 시신경 신경 장해에 대한 중요한 실험 질병 모델,이 모델에서는 녹내장 등 시신경 점차 망막 신경절 세포의 apoptosis에 이르게하는 호감의 부상이다. 이 질병 모델의 연결을 죽음과 치료 대책의 발전을 위해 필수적이며, 생존의 일반적인 프로세스와 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 약리 및 분자 방법은 광학 신경 장해 다양한 유형의 치료에 잠재적인 치료 시약을 파악하고 테스트하는이 모델에 사용할 수 있습니다.
여기, 우리는 일 1 망막 신경절 세포의베이스 라인 역행 라벨 (RGCs), 하루 4 (II) 광학 신경 호감 부상, (III) retinae를 수확하고 하루 RGC 생존 분석 (I)의 단계 시범에 의해 단계를 제공합니다 11과 (IV) 대표 결과.
Protocol
사용된 모든 장비와 시약이 멸균됩니다. 모든 동물 실험은 동물 케어 승인 및 (동물 연구 프로토콜 네이 - 570) 네이 / NIH에서위원회 (ACUC)를 사용하고, NIH의 지침과 규정에 따라 수행 하였다.
1. 1 일에서 망막 신경절 세포의 퇴행성 기준 라벨링 (RGCs)
이 절차의 목적은 삼일 시신경의 호감 부상하기 전에 생쥐의 우수한 colliculus에 신경 추적 염료를 주입하여 망막 신경절 retrogradely 세포 레이블을하는 것입니다. 염료 retrogradely 망막 신경절 세포에 의해 촬영과 생활 RGCs (그림 1)에 대한 마커를 제공하는 것입니다. 이 방법은 약간의 변화 1-5로 가능한 RGCs의 재현성 라벨을 산출.
- 깊이 마우스를 마취. 머리 위에 머리를 청소합니다. 작은 stereotaxic 장치에서 마우스를 놓습니다. 보호 oinment는 두 눈을에 적용됩니다. 머리 피부를 소독 세 번 iodophor과 70 % 알코올 스크럽을 사용하여 각.
- 두개골을 노출하기 위해 피부에 절개를하고, 3 % 과산화수소를 사용하여 그것이 건조하고 깨끗하게 유지.
- 식별 및 bregma을 표시합니다. bregma 뒤에 2.9 mm 각 반구 7 정중선을 가로 0.5 mm에서 우수한 colliculus 위에 구멍을 드릴. 드릴링하는 동안 구멍이 보조 열 부상을 방지하기 곤란있는 사이트로 살린 적용됩니다.
- stereotaxic 측정 장치와 해밀턴 주사기를 사용하여 두뇌의 골질 표면으로부터 1.6 mm의 깊이 각 반구의 우수한 colliculus로 매우 느리게 FluoroGold 신경 추적 염료 (3 % 1 μl 호수에서 Fluorochrome)을 주입.
- 절개 사이트를 봉합해. 진통제에 대한 buprenorphine의 피하 주사를 제공합니다.
- 따뜻하고 건조한 지역에 마우스를 이동하고 똑바로 자세를 유지하며, 홈 케이지로 돌아갈 수 때까지 그것을 모니터합니다. 라벨 절차 후 3 일 동안, 체계 진통제 (예, buprenorphine) 및 국소 항생 연고는 회 부여되고 마우스가 밀접하게 모니터합니다.
2. 일 4 시신경의 호감 상해
이 절차에서는, 우리는 망막 신경절 세포의 점진적인 죽음에 이르게됩니다 axons에 대한 기본 손상 (그림 2)을 일으킬 수있는 시신경에 호감 부상을 적용합니다.
- 추적 염료 신청 후 3 일, 마우스 깊이 anesthetized입니다. 해부 현미경을 사용 한 눈 결막은 봄 가위를 사용하여 4시 입장에 대한에 베인 수 있습니다.
- 부드럽게 궤도 근육 비켜 그들을 제쳐두기. 눈 세계로부터 출구에서 흰색 시신경을 폭로. 모든 혈관을 손상하지 않도록 아주 조심 해요.
- 크로스 액션 포셉 한 켤레의 도움으로 약 3 초 동안 안구에서 약 2 mm에서 시신경에 호감 부상을 적용합니다. 출혈을 일으킬 수있는 안과 동맥을 손상하지 않도록 아주 조심 해요.
- 호감 부상의 완료 후, 절개는 봉합합니다.
- 마우스가 마취에서 회복하기 전에 진통제에 대한 buprenorphine의 피하 주사를 제공합니다.
- 그것이 똑바로 자세를 유지하고 홈 케이지로 돌아갈 수 때까지 따뜻하고 건조한 지역에 마우스를 이동하고 모니터링합니다. 호감 부상 절차 후 3 일 동안, 체계 진통제 (예, buprenorphine) 및 국소 항생 연고는 회 부여되고 마우스가 밀접하게 모니터합니다.
3. Retinae를 수확하고 일 11시 RGC 서바이벌 분석
이 절차의 목적은 retinaeto가 망막 신경절 세포의 생존을 분석 수확하는 것입니다.
- 11 (ONC 매일 7) 하루, 마우스는 CO 2 주입 및 경추 전위에 의해 euthanized있다.
- 눈은 궤도에 압력을 적용하여 포셉 한 켤레의 도움으로 enucleated 있습니다.
- 눈은 두 시간 동안 4 % paraformaldehyde 용액에 고정하고 PBS로 세 번 씻어 있습니다. 망막을 해부하다. 망막의 해부의 과정은 이미 6. Gustmann, S. 외 의해 2010 년 정돈 이전에 출판되어 있으며, 따라서 여기서 설명되지 않습니다.
- 살아 망막 신경절 세포의 이미지는 망막의 정의 지역에서 형광 현미경을 사용하여 촬영하고, 망막 신경절 세포 밀도가 계산하실 수 있습니다. 시신경의 호감 부상 여부에 상관없이 형광 - 표시 망막 신경절 세포의 대표적인 결과는 그림 3에 표시됩니다.
4. 대표 결과 :
망막 신경절 세포의 생존, 시신경의 호감 부상 후 7 일 분석하려면 retinae는 고정, 수확 평평하고 장착했습니다. 망막 이미지는 형광 현미경을 사용하여 촬영되었다. 손상되지 않은 정상적인 R과 비교etina은 (일반, 왼쪽), 실용적 RGCs의 번호는 (retrogradely 우수한 colliculus로 주입 FluoroGold 신경 추적 염료로 표시된 녹색) 시신경의 호감 부상 (오른쪽, ONC) (그림 3)과 retinae 크게 낮은 .
그림 1. 망막 신경절 세포의베이스 라인 후퇴 라벨링
시신경의 호감 부상 후 다른 시간 지점에서 가능한 망막 신경절 세포를 계산하기 위해 망막 신경절 세포는 (시신경 전에 뇌 사흘 만에 우수한 colliculus에 신경 추적 염료 (녹색 색상)을 주사하여 retrogradely 레이블 아르 적색) 호감 부상. 망막 신경절 세포의 axons이 우수한 colliculus에 거주하고 있으므로, 추적 염료 retrogradely RGCs 의해 촬영과 생활 RGCs에 대한 마커를 제공하는 것입니다.
그림 2. 시신경의 호감 부상
망막 신경절 세포의 생존의 상태를 분석하기 위해서는, 호감 부상은 axons에 기본 피해를 입을 수있는 시신경 (적색)에 적용됩니다. 이것은 망막 신경절 세포의 점진적인 죽음을 초래합니다. 추적기 색소 (녹색) 분사 후 3 일, 마우스 anesthetized입니다. 눈 하나의 결막이 베인입니다. 궤도 근육 비켜 그들을 제쳐두기. 눈 세계로부터 출구에서 시신경을 쉽게받을 수 있습니다. 크로스 액션 포셉 한 쌍의를 사용하여 약 3 초 동안 안구에서 약 2 mm에서 시신경에 호감 부상을 적용합니다.
그림 3. 형광 - 표시 시신경의 호감 부상 여부와 상관없이 망막 신경절 세포
망막 신경절 세포의 생존, 시신경의 호감 부상 후 7 일 분석하려면 retinae는 고정, 수확 평평하고 장착했습니다. 망막 이미지는 형광 현미경을 사용하여 촬영되었다. 손상되지 않은 정상적인 망막 (일반, 왼쪽)와 비교할 때, 가능한 RGCs의 숫자 (녹색, retrogradely 우수한 colliculus로 주입 FluoroGold 신경 추적 염료로 표시)은 시신경의 호감 부상 (오른쪽, ONC와 retinae 크게 낮은 ) (그림 3). 스케일 바 : 50 μm의
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Discussion
시신경의 호감 부상 murine 모델 RGC 죽음과 생존의 과정을 연구하는 데 유용합니다. 이 모델은 또한 종종 RGC apoptosis과 생존에 다른 시약과 유전자의 효과를 조사하는 데 사용됩니다. 이 모델의 장점은 최소한의 변화와 재현성의 높은 수준을 가지고있다는 사실이다.
그러나, 특별한주의가이 모델의 몇 가지 단계가 필요합니다. 첫째, 시신경의 호감 부상을 만들 때, 그것은 그들이 안과 동맥 따라서 이후 망막 국소 빈혈에 손상을 초래할 수 있기 때문에, 너무 무력을 사용하지 않으며 너무 오랫동안 호감하지 필수적입니다. 또한 시신경을 폭로하려고 할 때, 하나는 마우스 눈 주위의 다른 혈관을 손상하지 않도록 큰주의를 기울여야한다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리의 연구는 NIH, 국립 안과 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic apparatus | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Suture needle | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 88400 | |
| Gauze sponges | Office Depot | 674889 | |
| Fluorochrome | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Alcohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
References
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
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- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
