Summary
نحن هنا وصف الإجراء يسمح للتوسيم
Abstract
بينما الإدواردسيلة ictaluri هو الممرض الرئيسي للقناة السلور Ictalurus punctatus ولقد تم اكتشاف ما يقرب من ثلاثة عقود مضت 1،2 ، حتى الآن ، أفضل من هذه المعرفة من الكتاب ، وقد وضعت توجد طريقة للسماح التصور في الموقع من البكتيريا الموجودة في المقاطع النسيجية.
في حين تم تحديد توطين الجرثومي في الجسم الحي في الدراسات السابقة باستخدام لوحة العد 3 ، 4 الراديومترية المسمى ، أو البكتيريا bioluminescent 5 ، إلا أن معظم هذه الدراسات أجريت على مستوى الجهاز الإجمالي ، مع استثناء واحد 6. هذا القيد هو مصدر قلق خاص لأن E. ictaluri لديه دورة العدوى 1،7 معقدة ، ولها مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة 8،9. التفاعل المعقد بين هاء ictaluri مع مضيفه تشبه من نواح كثيرة لالسالمونيلا التيفية 10 ، وهو في نفس العائلة التصنيفية.
نحن هنا وصف تقنية تسمح للكشف عن بكتيريا غير المباشرة باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة Ed9 اينسورث التي وصفها آخرون 11.
باختصار ، يتم تطبيق حظر على المصل المقاطع النسيجية جزءا لا يتجزأ من البرافين لمنع غير محددة المتعهدة. ثم يتم تحضين المقاطع مع الضد الابتدائي : E. ictaluri ريتوكسيماب Ed9 محددة. يتم شطف الأضداد الزائدة بعيدا وتضاف FitC الأضداد الثانوي المسمى. بعد الشطف ، هي التي شنت المقاطع مع وسيلة معينة الفلورسنت المتزايدة.
هذا يسمح للكشف عن E. ictaluri في الموقع في الفروع النسيجي للأنسجة سمك السلور القناة.
Protocol
1. البكتيرية التحدي
- تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في الدماغ تهتز مرق تسريب القلب.
- وقف توزيع المياه في خزانات الأسماك وإضافة مرق في تركيز 1 في 100 (10 مل لكل لتر ، على سبيل المثال).
- بعد ساعة واحدة الحضانة ، إعادة دوران المياه في خزانات لطرد البكتيريا المتبقية.
2. أخذ العينات
- أوقات لأخذ العينات وأجهزة تعتمد على الهدف من الدراسة ولكن في دراستنا ، استخدمنا نقاط أخذ العينات التالية : 1 ، 6 ، 16 ، 24 ، 36 ، 48 ، 60 ، 72 ، 96 ، 110 ، 125 و 175 ساعة بعد الإصابة .
- في كل النقاط الزمنية ، الموت ببطء ست أسماك عن طريق الغمر في الماء الذي يحتوي على MS222 وأخذ عينات من الأجهزة التالية (وقد استند اختيار عينات من الأجهزة على ما هو معروف من عملية الإصابة) : الخياشيم والعضلات الخلفية على طول الخط الجانبي والأمعاء والطحال ، الكبد والمعدة والقلب والكلى الرأس والجذع والكلى.
- عند أخذ العينات ، وتحميل على الفور في أجهزة الأشرطة النسيجية وتزج بهم لمدة ساعتين في الفورمالين 1 ٪.
- بعد تثبيت ساعتين ، ونقل الأشرطة من الفورمالين الى الايثانول بنسبة 50 ٪ حيث ما زالوا حتى التضمين.
- تضمين البارافين الأجهزة باستخدام منديل ورقي بين عشية وضحاها تيك VIP النسيج المعالج 3000 (ساكورا تك ، تورانس ، كاليفورنيا) ، والقسم في 5μm باستخدام RM2255 microtone ايكا (لايكا مايكروسيستمز ، بانوكبورن ، إلينوي).
3. Dewaxing المقاطع
- تزج المقاطع في حوض مليء تلطيخ طقوس واضحة لنحو 5 دقائق للسماح للشمع كل حل. رفع الرف وتصريف فائض الشمع المذيبات.
- تزج المقاطع في حاوية الثاني من طقوس واضحة لمدة 5 دقائق. بعد قليل يستخدم استبدال المذيبات في الحاوية الأولى وبالتناوب بين الحاويات الأولى والثانية.
- تزج المقاطع في الكحول بنسبة 100 ٪ لإزالة الشمع المذيبات.
- تزج المقاطع في حوض الثاني من الكحول بنسبة 100 ٪.
- تزج المقاطع في حوض من الكحول 70 ٪.
- تزج تشغيل المقاطع في ماء الصنبور لإزالة كل آثار الكحول.
4. إعداد العازلة
- إعداد الفوسفات مخزنة المالحة عن طريق إذابة 8.0 جرام كلوريد الصوديوم ، 0.2 غرام بوكل ، 1،15 ز نا 2 هبو 4 و 0.2 غرام KH 2 PO 4 في 1 لتر من الماء المقطر ، والرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
- برنامج تلفزيوني لتمييع 0.9X بإضافة 900 مل من برنامج تلفزيوني و 100 مل من الماء المقطر.
- إعداد حجب المصل بإضافة 2 مل مصل الفأر ؛ 200 ميكرولتر تريتون - X 100 و 500 لجيش صرب البوسنة ميكرولتر 50 مل من برنامج تلفزيوني 0.9X.
- تعد مستعدة لتحلية بيكربونات 50 ملي التخزين المؤقت عن طريق إذابة 2.1 جم NaHCO 3 و 4 ز كلوريد الصوديوم في 500 مل المقطر O 2 H ومعاير لدرجة الحموضة 8.2.
5. Immunhistochemistry
- ترطيب المقاطع في برنامج تلفزيوني عن طريق الغمر 0.9X.
- احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في حجب المصل.
- المقاطع في احتضان Ed9 (مخفف 1 في 100 مصل في حجب) لمدة ساعتين في غرفة رطبة an مبهمة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف القسمين 4 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان المقاطع لمدة ساعتين في 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة الماوس الأضداد FitC المسمى ؛ المخفف 500 مرة في حجب المصل) في حجرة رطبة an مبهمة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف المقاطع 3 مرات في بيكربونات مخزنة المالحة.
- شطف في الماء لفترة وجيزة المقاطع منزوع الأيونات.
6. متزايد
- يترك ليجف الشرائح في ظلام دامس لمدة بضع دقائق.
- يتم تنفيذ متزايدة باستخدام permafluor.
- مغادرة المتوسطة المتزايدة لتجف ، بين عشية وضحاها تفضيلي ، في بيئة مظلمة وباردة.
7. مجهر
- المقاطع النسيجية مستعدون لمراقبة تحت المجهر الفلورسنت. في تجربتنا ، استخدمنا BX51 أوليمبوس المجهر مجهزة (FitC ؛ MCA تكساس الأحمر) ثلاثية التصفية. تم استخدام البرمجيات إطار صورة (MicroFire ، Goleta ، كاليفورنيا).
8. ممثل النتائج :
لأن صناعة السيارات في مضان من أنسجة الأسماك مرتفعة جدا ، وسوف تظهر هذه الأنسجة البرتقالي تحت التصفية ، تري ، وتوفير خلفية مناسبة للبكتيريا.
على هذه الخلفية ، فإن الفرد البكتيريا ملطخة FitC تظهر كنقاط خضراء زاهية ، وشكلها في 200X قضيب سيتم التعرف عليها (الشكل 1).
ويمكن المقاطع السيئة تشكل إيجابية كاذبة (بسبب مشكلة في مرحلة الشطف) ، وفي هذه الحالة على عدد كبير من البكتيريا سوف تظهر بشكل موحد ليكون حاضرا على الشريحة.
الشكل 1. صورة مجهرية لعرض العضلات المقاطع two E. ictaluri (سهام أ و ب) (200X).
igure 2 "/>
الشكل 2. الخطة الشاملة للتجربة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول تفاصيل تقنية عن التصور في الموقع من ictaluri الممرض الإدواردسيلة سمك السلور في الفروع النسيجية. إلى حد علمنا ، وهذا هو أول بروتوكول من هذا القبيل وصفها.
الخطوة الأكثر أهمية ، في تجربتنا ، هو الشطف من الأضداد كما هو موضح في الخطوة 4.4 من هذا البروتوكول وغسل كافية قد يؤدي إلى إيجابية كاذبة.
المشكلة الرئيسية مع تفسير نتائج هذه التقنية هو لصناعة السيارات في مضان من الأنسجة. ومع ذلك ، فقد وجد أن استخدام ثلاثي تصفية معظمهم أن تحل المشكلة ، لأن الغالبية العظمى من مضان غير محددة تقع خارج الطيف الفلورية الخضراء. أيضا ، في حين أن هذا الأسلوب هو حساس جدا ، ويمكن ان تفشل في الكشف عن الأحمال البكتيرية منخفضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب ترغب في التعرف على المساعدة التقنية من بانيس ميشيل وكذلك الدكتور هانسون ، بيتري ، الأنقليس الدكتور تيموثي براون ولما قدموه من مساعدة البلدان النامية وتنفيذ المناعية. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وزارة الزراعة الأميركية كريس المشروع # MISV - 0801310 وكلية جامعة ولاية ميسيسيبي للطب البيطري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
- Plumb, J. A. Fish Diseases and Disorders. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. Fish Pathology. , third ed, WB Saunders. (2001).
- Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W. Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
