Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het gebruik van TL-Immuno-Chemie voor de detectie van Edwardsiella ictaluri In kanaal meerval ( I. punctatus) Monsters

Published: May 10, 2011 doi: 10.3791/2687

Summary

Hier beschrijven we een procedure om de etikettering van

Abstract

Terwijl Edwardsiella ictaluri is een belangrijke ziekteverwekker van kanaal meerval Ictalurus punctatus en heeft ontdekt bijna drie decennia geleden 1,2, tot nu toe, om de beste van deze auteurs de kennis, is geen methode ontwikkeld om voor het laten in situ visualisatie van de bacteriën in histologische secties.

Terwijl de bacteriële lokalisatie is vastgesteld in vivo in eerdere studies met plaattellingen 3, radiometrische gelabeld 4 of 5 bioluminescente bacteriën, zijn de meeste van deze studies is alleen uitgevoerd op de bruto-orgel niveau, met een uitzondering 6. Deze beperking is van bijzonder belang, omdat E. ictaluri heeft een complexe infectie cyclus 1,7, en het heeft een aantal virulentiefactoren 8,9. De complexe interactie van E. ictaluri met zijn gastheer is in veel opzichten vergelijkbaar met Salmonella typhi 10, die in dezelfde taxonomische familie.

Hier beschrijven we een techniek waardoor de detectie van bacteriën met behulp van indirecte immuno-histochemie met behulp van het monoklonale antilichaam Ed9 beschreven door Ainsworth et al.. 11.

In het kort, is een blokkerende serum toegepast op paraffine ingebedde histologische secties van niet-specifieke afwachtende voorkomen. Vervolgens worden de secties geïncubeerd met het primaire antilichaam: E. ictaluri specifieke monoklonale antilichaam Ed9. Overtollige antilichamen zijn weggespoeld en de FITC gemerkte secundaire antilichamen worden toegevoegd. Na het spoelen, zijn de secties gemonteerd met een fluorescerende specifieke montage-medium.

Dit toegestaan ​​voor de detectie van E. ictaluri in situ in histologische secties van het kanaal meerval weefsels.

Protocol

1. Bacteriële uitdaging

  1. Groeien bacteriën 's nachts bij 30 ° C in schudden Brain Heart Infusion bouillon.
  2. Stop met water circulatie in de aquaria en voeg bouillon in de concentratie van 1 op de 100 (10 ml per liter, bijvoorbeeld).
  3. Na een uur incubatie, start watercirculatie in de tanks te spoelen de resterende bacteriën.

2. Monsterneming

  1. Bemonsteringsduur en organen hangt af van het doel van de studie, maar in onze studie gebruikten we de volgende meetpunten: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 en 175 uur na infectie .
  2. Op elk tijdstip punten euthanaseren zes vissen door onderdompeling in water met MS222 en proef de volgende organen (selectie van de bemonsterde organen was gebaseerd op wat bekend is van de infectie proces): kieuwen, achterste spieren langs de zijlijn, darm, milt, lever, maag, hart, hoofd nieren, en de romp nier.
  3. Bij de bemonstering, onmiddellijk laden de organen in histologische cassettes en dompel ze gedurende twee uur in 1% formaline.
  4. Na twee uur fixatie, overdracht van de cassettes van formaline tot 50% ethanol, waar ze blijven tot inbedding.
  5. Paraffine embed organen 's nachts met behulp van een tissue-Tek VIP 3000 tissue processor (Sakura Tek, Torrance, Californië) en sectie 5 urn met behulp van een Leica RM2255 microtone (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois).

3. Ontdoen secties

  1. Dompel de secties in een kleuring bak gevuld met helder-rite voor ongeveer 5 minuten om alle was op te lossen. Til de rek-en afvoer overtollige wax oplosmiddel.
  2. Dompel de secties in een tweede container van clear-rite gedurende 5 minuten. Na een paar gebruikt, vervangen door het oplosmiddel in de eerste container en wisselen tussen de eerste en tweede containers.
  3. Dompel de secties in 100% alcohol het verwijderen van de wax oplosmiddel.
  4. Dompel de secties in een tweede dieptepunt van 100% alcohol.
  5. Dompel de secties in een dieptepunt van 70% alcohol.
  6. Dompel de secties in stromend water om alle sporen van alcohol te verwijderen.

4. Buffer voorbereiding

  1. Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing door het oplossen van 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na 2 HPO 4 en 0,2 g KH 2 PO 4 in 1 liter gedestilleerd water en pH 7,4.
  2. Verdunnen PBS tot 0.9x door het toevoegen van 900 ml PBS tot 100 ml gedestilleerd water.
  3. Bereid het blokkeren van het serum door toevoeging van 2 ml serum muis; 200 ul Triton-X 100 en 500 ul BSA aan 50 ml 0,9 x PBS.
  4. Bereid 50 mM Bicarbonaat gebufferde fysiologische zoutoplossing wordt bereid door het oplossen van 2,1 g NaHCO 3 en 4 g NaCl in 500 ml gedestilleerd H 2 O en getitreerd tot pH 8,2.

5. Immunhistochemistry

  1. Hydrateren secties door onderdompeling in 0.9x PBS.
  2. Incubeer de glaasjes gedurende 30 minuten in het blokkeren van serum.
  3. Incubeer secties in Ed9 (verdund 1 op 100 in de blokkering serum) gedurende twee uur in een ondoorzichtige vochtige kamer bij kamertemperatuur.
  4. Spoel hoofdstukken 4 keer in PBS gedurende 10 minuten elk.
  5. Incubeer secties voor twee uur in 50 ui van het secundaire antilichaam (geit anti-muis FITC-gelabelde antilichamen; verdund 500 keer in het blokkeren van serum) in een ondoorzichtige vochtige kamer bij kamertemperatuur.
  6. Spoel secties 3 keer in Bicarbonaat gebufferde zoutoplossing.
  7. Spoel kort secties in gedeïoniseerd water.

6. Montage

  1. Laat de dia's in het donker drogen voor een paar minuten.
  2. Montage is uitgevoerd met behulp van permafluor.
  3. Laat de bevestiging medium te drogen, bij voorkeur 's nachts, in een donkere koele omgeving.

7. Microscoop

  1. Histologische coupes staan ​​klaar om te observeren onder een fluorescentiemicroscoop. In ons experiment gebruikten we een Olympus BX51 microscoop uitgerust met een drievoudige (FITC, MCA Texas-Rood) filter. De Picture Frame-software (MicroFire, Goleta, California) werd gebruikt.

8. Representatieve resultaten:

Omdat de auto-fluorescentie van vis weefsels zo hoog is, zal deze weefsels oranje verschijnen onder de Tri-filter, die een gunstige achtergrond voor de bacteriën.

Tegen deze achtergrond zal de individuele FITC gekleurde bacteriën verschijnen als fel groene stippen, en op 200X hun hengel vorm zal herkenbaar zijn (afb. 1).

Bad secties kunnen vormen vals positieve (als gevolg van een probleem in de spoel-fase), in welk geval een groot aantal bacteriën zal verschijnen aanwezig te zijn uniform op de dia.

Figuur 1
Figuur 1. Microfoto van een spier delen met twee E. ictaluri (pijlen a en b) (200x).

igure 2 "/>
Figuur 2. Algehele opzet van het experiment

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol details een techniek voor de in situ visualisatie van de meerval pathogeen Edwardsiella ictaluri in histologische secties. Om het beste van onze kennis, is dit de eerste beschreven dergelijk protocol.

De meest kritische stap, in onze ervaring, is het spoelen van de antilichamen zoals beschreven in de stap 4.4 van het huidige protocol, omdat onvoldoende wassen kan leiden tot valse positieve.

Het grootste probleem met het interpreteren van de resultaten van deze techniek is de auto-fluorescentie van het weefsel. Er werd echter vastgesteld dat het gebruik van de Tri-filter meestal dat probleem opgelost als de overgrote meerderheid van de niet-specifieke fluorescentie optreden buiten de green fluorescent spectrum. Ook, terwijl deze techniek is zeer gevoelig zijn, kan het niet aan een lage bacteriële belastingen op te sporen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs willen de technische bijstand van Michelle Banes evenals dr. Petrie-Hanson, Dr Alen en Timothy Brown herkennen voor hun hulp het ontwikkelen en uitvoeren van de immunohistochemie. Dit project werd gefinancierd door USDA CRIS project # MISV-0801310 en door de Mississippi State University College of Veterinary Medicine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Infusion broth BD Biosciences 237200
MS222 Argent Labs
Whole mouse Serum Cappel 55989
Goat anti-mouse FitC SouthernBiotech 1010-04
Permafluor Lab Vision Ta-030-FM
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P-4504
Triton-X Sigma-Aldrich X100-6X500ML
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 85040C
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P-5379
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S-5761
Sodium chloride (NaCal) Sigma-Aldrich S-9625
Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) Sigma-Aldrich S-9390

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plumb, J. A. Fish Diseases and Disorders. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).
  2. Roberts, R. J. Fish Pathology. , third ed, WB Saunders. (2001).
  3. Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).
  4. Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
  5. Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
  6. Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
  7. Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
  8. Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
  9. Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
  10. Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
  11. Hook, E. W. Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).
  12. Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).

Tags

Immunologie immunohistochemie histologie Edwardsiella ictaluri enterische septikemie van het kanaal meerval vis meerval Ictalurus punctatus
Het gebruik van TL-Immuno-Chemie voor de detectie van<em> Edwardsiella ictaluri</em> In kanaal meerval (<em> I. punctatus</em>) Monsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. More

Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples. J. Vis. Exp. (51), e2687, doi:10.3791/2687 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter