Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren auszuarbeiten, die Kennzeichnung von
Abstract
Während Edwardsiella ictaluri ist ein wichtiger Erreger der Kanal Wels Ictalurus punctatus und wurde vor fast drei Jahrzehnten 1,2 entdeckt, so weit, zu den besten dieser Autoren "Wissen ist keine Methode entwickelt worden, um für die in situ Visualisierung der damit Bakterien in histologischen Schnitten.
Während bakterielle Lokalisation in vivo in früheren Studien mit Platte zählt 3, radiometrische markierte 4, oder Biolumineszenz-Bakterien 5 ermittelt wurde, haben die meisten dieser Studien nur auf die Brutto-Orgel Ebene durchgeführt worden, mit einer Ausnahme 6. Diese Einschränkung ist besonders besorgniserregend, weil E. ictaluri hat eine komplexe Infektionszyklus 1,7, und es hat eine Vielzahl von Virulenzfaktoren 8,9. Das komplexe Zusammenspiel von E. ictaluri mit seinem Gastgeber ist in vieler Hinsicht ähnlich zu Salmonella typhi 10, die in der gleichen taxonomischen Familie ist.
Hier beschreiben wir eine Technik die es erlaubt die Detektion von Bakterien mittels indirekter Immunhistochemie mit dem monoklonalen Antikörper, der von ED9 Ainsworth et al. 11.
Kurz gesagt, ist ein Blockierserum auf Paraffin eingebetteten histologischen Schnitten angewendet, um unspezifische abwartend zu verhindern. E.: Dann werden die Schnitte mit dem primären Antikörper inkubiert ictaluri spezifischen monoklonalen Antikörper ED9. Überschüssige Antikörper werden entfernt und spülte den FITC-markierten Sekundärantikörper hinzugefügt werden. Nach dem Spülen werden die Schnitte mit einem fluoreszierenden spezifischen Eindeckmedium montiert.
Diese für den Nachweis von E. erlaubt ictaluri in situ in histologischen Schnitten von Kanal Wels Gewebe.
Protocol
1. Bakterielle Herausforderung
- Bakterien wachsen über Nacht bei 30 ° C in Schüttel Brain Heart Infusion Broth.
- Stoppen Wasserzirkulation in den Fischbecken und Brühe in einer Konzentration von 1 in 100 (10 ml pro Liter, zum Beispiel).
- Nach einer einstündigen Inkubation, starten Wasserzirkulation in den Tanks zu spülen, die restlichen Bakterien.
2. Stichprobenverfahren
- Abtastzeiten und Organe hängt von der Zielsetzung der Studie, aber in unserer Studie haben wir die folgenden Messstellen: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 und 175 Stunden nach der Infektion .
- Zu jedem Zeitpunkt Punkten euthanize sechs Fische durch Eintauchen in Wasser mit MS222 und probieren Sie die folgenden Organe (Auswahl der Organe abgetastet wurde, was ist der Ablauf der Infektion bekannt ist): Kiemen, hinteren Muskeln entlang der Seitenlinie, Darm, Milz, Leber, Magen, Herz, Kopf Niere und Kofferraum Niere.
- Nach Probenahme, sofort laden die Organe in histologischen Kassetten und tauche sie für zwei Stunden in 1% Formalin.
- Nach zwei Stunden Fixierung, übertragen Sie die Kassetten aus Formalin zu 50% Ethanol, wo sie bis Einbettung bleiben.
- Paraffin eingebettet Organe über Nacht mit einem Gewebe-Tek VIP 3000 Gewebe-Prozessor (Sakura Tek, Torrance, Kalifornien) und Abschnitt bei 5 um mit einem Leica RM2255 microtone (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois).
3. Entwachsen Abschnitte
- Tauchen Sie die Abschnitte in einem Färbetrog mit klar-rite für ca. 5 Minuten gefüllt, um für das gesamte Wachs zu lösen lassen. Heben Sie die Rack-und abtropfen überschüssige Wachs Lösungsmittel.
- Tauchen Sie die Teile in einen zweiten Behälter aus klarem Ritus für 5 Minuten. Nach ein paar verwendet, ersetzen Sie das Lösungsmittel in den ersten Behälter und wechseln zwischen dem ersten und dem zweiten Behälter.
- Tauchen Sie die Abschnitte in 100% igem Alkohol zu entfernen das Wachs Lösungsmittel.
- Tauchen Sie die Abschnitte in einem zweiten Trog von 100% igem Alkohol.
- Tauchen Sie die Teile in einem Trog von 70% Alkohol.
- Tauchen Sie die Abschnitte in fließendem Leitungswasser, um alle Spuren von Alkohol zu entfernen.
4. Buffer Vorbereitung
- Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung durch Auflösen von 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na 2 HPO 4 und 0,2 g KH 2 PO 4 in 1 Liter destilliertem Wasser und pH-Wert auf 7,4.
- Verdünnen PBS auf 0.9X durch Zugabe von 900 ml PBS auf 100 ml destilliertem Wasser.
- Bereiten Blockierserum durch Zugabe von 2 ml Maus-Serum, 200 ul Triton-X 100 und 500 ul BSA in 50 ml 0.9X PBS.
- Bereiten 50 mM Bicarbonat-gepufferte Kochsalzlösung durch Auflösen von 2,1 g NaHCO 3 und 4 g NaCl in 500 ml destilliertem H 2 O und titriert bis pH 8,2 hergestellt.
5. Immunhistochemie
- Rehydrieren Abschnitte durch Eintauchen in 0.9X PBS.
- Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten in Blockierserum.
- Inkubieren Abschnitte in ED9 (verwässert 1 in 100 in der Blockierserum) für zwei Stunden in einem undurchsichtigen feuchten Kammer bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie den Abschnitten 4 mal in PBS für jeweils 10 Minuten.
- Inkubieren Abschnitte für 2 Stunden in 50 ul der Sekundärantikörper (Ziege anti-Maus FITC-markierten Antikörper, verdünnt 500 Mal in Blockierserum) in einem undurchsichtigen feuchten Kammer bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie den Abschnitten 3 mal in Bicarbonate Kochsalzlösung.
- Spülen Abschnitten wird kurz in VE-Wasser.
6. Montage
- Lassen Sie die Folien in der Dunkelheit für ein paar Minuten trocknen lassen.
- Montage erfolgt mit Hilfe permafluor.
- Lassen Sie die Montage mittel-bis trocken, bevorzugt über Nacht in einem dunklen kühlen Umgebung.
7. Mikroskop
- Histologische Schnitte sind bereit, unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten. In unserem Experiment haben wir ein Olympus BX51 Mikroskop mit einer Dreifach-(FITC; MCA Texas-Rot) ausgestattet Filter. Der Picture Frame Software (Microfire, Goleta, Kalifornien) verwendet wurde.
8. Repräsentative Ergebnisse:
Da die Autofluoreszenz von Fischgeweben so hoch ist, wird diese Gewebe erscheinen unter dem Tri-Filter orange, bequem bietet den Hintergrund für die Bakterien.
Vor diesem Hintergrund werden die einzelnen FITC gefärbten Bakterien als helle grüne Punkte erscheinen und bei 200X ihre Stabform wird erkennbar sein (Abb. 1).
Bad Abschnitte darstellen können falsch-positive (aufgrund eines Problems in der Spül-Phase), in welchem Fall eine große Anzahl von Bakterien zu sein scheinen gleichmäßig auf der Folie präsentieren.
Abbildung 1. Mikroskopische Aufnahme eines Muskels Abschnitte mit zwei E. ictaluri (Pfeile a und b) (200x).
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Abbildung 2. Gesamtkonzept des Experiments
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Discussion
Dieses Protokoll Details eine Technik, die in situ Visualisierung der Welse Erreger Edwardsiella ictaluri in histologischen Schnitten. Um das Beste aus unserer Kenntnis ist dies die erste derartige Protokoll beschrieben.
Der wichtigste Schritt, in unserer Erfahrung ist das Spülen der Antikörper wie im Schritt 4.4 der vorliegenden Protokoll als unzureichend Waschen kann sich in der falsch-positiven Ergebnis.
Das Hauptproblem bei der Interpretation der Ergebnisse dieser Technik ist die Autofluoreszenz des Gewebes. Es wurde jedoch festgestellt, dass mit dem Tri-Filter meist löste dieses Problem, wie die überwiegende Mehrheit der nicht-spezifischen Fluoreszenz auftreten, die ausserhalb des grün fluoreszierenden Spektrum. Auch während dieser Technik sehr empfindlich ist, kann sie nicht auf niedrige bakterielle Belastungen zu erkennen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die technische Unterstützung von Michelle Banes sowie Dr. Petrie-Hanson, Dr. Aale und Timothy Brown für ihre Unterstützung der Entwicklung und Durchführung der Immunhistochemie zu erkennen. Dieses Projekt wurde von USDA CRIS Projekt # MISV-0801310 und der Mississippi State University College of Veterinary Medicine finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
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