השימוש פלורסנט חיסונית-לכימיה לצורך זיהוי של Edwardsiella ictaluri ב שפמנון ערוץ ( א punctatus) דגימות

Summary

כאן אנו מתארים את הליך המאפשר תיוג

Abstract

בעוד Edwardsiella ictaluri הוא הפתוגן העיקרי של שפמנון ערוץ Ictalurus punctatus כבר גילו כמעט שלושה עשורים לפני ^1,2, עד כה, לפי מיטב הידע של הסופרים האלה, השיטה לא פותחה כדי לאפשר ב להדמיה מקומית של חיידקים בסעיפים היסטולוגית.

בעוד לוקליזציה חיידקי נקבע in vivo במחקרים קודמים באמצעות ספירת צלחת ^{3, 4} שכותרתו רדיומטרי, או חיידקים bioluminescent ^5, רוב המחקרים בוצעו רק ברמה איבר ברוטו, עם חריג אחד ^6. הגבלה זו מדאיג במיוחד כי א ictaluri יש מחזור זיהום ^1,7 מורכבות, ויש לה מגוון גורמים ארסיות ^8,9. האינטראקציה המורכבת של E. ictaluri עם המארח שלו הוא דומה במובנים רבים Salmonella typhi ^10, אשר בתוך המשפחה הטקסונומית.

כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת זיהוי של חיידקים באמצעות עקיפה חיסונית histochemistry באמצעות נוגדן חד שבטי Ed9 שתואר על ידי Ainsworth et al. ^11.

בקצרה, סרום חסימת מוחל בסעיפים פרפין מוטבע היסטולוגית כדי למנוע הלא ספציפית ממתין. ואז, הסעיפים מודגרת עם הנוגדן עיקריים: א ictaluri נוגדן חד שבטי ספציפי Ed9. נוגדנים הם עודף ושטף ממנו את הנוגדנים FitC משני שכותרתו מתווספים. לאחר השטיפה, הקטעים הם רכובים עם פלורסנט בינוני הרכבה ספציפיות.

זה איפשר זיהוי של E. ictaluri באתרו בסעיפים היסטולוגית של הרקמות שפמנון הערוץ.

Protocol

1. חיידקי אתגר

1. חיידקים לגדול בין לילה ב 30 מעלות צלזיוס רועד הלב והמוח מרק עירוי.
2. הפסק זרימת המים באקווריומים ולהוסיף מרק בריכוז של 1 ל 100 (10 מ"ל לליטר, למשל).
3. לאחר הדגרה של שעה אחת, הפעל מחדש את זרימת המים הטנקים כדי לשטוף החוצה את החיידקים הנותרים.

2. דגימה

1. פעמים דגימה איברים תלוי המטרה של המחקר, אבל במחקר שלנו, השתמשנו נקודות דיגום הבאים: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 ו - 175 שעות לאחר הפגיעה .
2. בכל נקודות הזמן, להרדים שישה דגים על ידי טבילה במים המכיל MS222 מדגם האיברים הבאים (מבחר האיברים שנדגמו היה מבוסס על מה שמכונה תהליך ההדבקה): זימים, השרירים האחוריים לאורך קו לרוחב המעי, טחול, , קיבה, כבד, לב, כליות הראש, כליות המטען.
3. לאחר הדגימה, מיד לטעון את האיברים קלטות היסטולוגית ו לטבול אותם במשך שעתיים ב 1% פורמלין.
4. לאחר קיבוע שעתיים, העברת קלטות של פורמלין אתנול 50% שם הם נשארים עד הטבעת.
5. פרפין להטביע איברים לילה באמצעות רקמה-Tek VIP 3000 מעבד רקמות (סאקורה Tek, טורנס, קליפורניה) ואת סעיף ב 5μm באמצעות RM2255 microtone לייקה (Leica Microsystems, Bannockburn, אילינוי).

3. Dewaxing בסעיפים

1. לטבול את הסעיפים שוקת מכתים מלא ברור טקס למשך כ 5 דקות, כדי לאפשר השעווה כל להתמוסס. הרם את המעמד לנקז עודפי שעווה ממס.
2. לטבול את החלקים במיכל השני ברור טקס במשך 5 דקות. לאחר כמה שימושים, החלף את הממס במיכל החלופי הראשון בין המכולות הראשונה והשניה.
3. לטבול את הסעיפים אלכוהול 100% כדי להסיר את השעווה ממס.
4. לטבול את הסעיפים שוקת השני של אלכוהול 100%.
5. לטבול את הסעיפים שוקת של אלכוהול 70%.
6. לטבול את החלקים במים זורמים ברז כדי להסיר את כל עקבות של אלכוהול.

4. הצפת הכנה

1. הכן פוספט שנאגרו מלוחים ידי המסת 8.0 גרם NaCl, KCl 0.2 גרם, 1.15 גרם Na ₂ HPO ₄ ו - 0.2 גרם KH ₂ PO ₄ לתוך 1 ליטר של מים מזוקקים עד pH 7.4.
2. מדולל PBS על 0.9X על ידי הוספת 900 מ"ל של PBS על 100 מ"ל של מים מזוקקים.
3. הכן חוסם בסרום על ידי הוספת 2 מ"ל עכבר בסרום; 200 μl טריטון X-100 ו - 500 μl BSA כדי 50 מ"ל של 0.9X PBS.
4. הכן 50 ביקרבונט mM מלוחים שנאגרו מוכן ידי המסת 2.1 גרם NaHCO ₃ ו 4 גרם NaCl בתוך 500 מ"ל מזוקקים H ₂ O ו טיטרציה pH 8.2.

5. Immunhistochemistry

1. רעננותם חלקים על ידי טבילה 0.9X PBS.
2. דגירה השקופיות במשך 30 דקות בתוך חסימת בסרום.
3. דגירה מקטעים Ed9 (בדילול 1 ב 100 בנסיוב חסימה) במשך שעתיים בחדר לח אטום בטמפרטורת החדר.
4. לשטוף סעיפים 4 פעמים PBS למשך 10 דקות כל אחד.
5. דגירה סעיפים שעתיים μl 50 של הנוגדן משני (אנטי עז עכבר נוגדנים FitC שכותרתו; בדילול 500 פעמים חסימת נסיוב) בתא לח אטום בטמפרטורת החדר.
6. יש לשטוף את סעיפים 3 פעמים ביקרבונט שנאגרו מלוחים.
7. יש לשטוף את החלקים במים deionized בקצרה.

6. הרכבה

1. השאירו את השקופיות להתייבש בחושך במשך כמה דקות.
2. הרכבה מבוצעת באמצעות permafluor.
3. השאירו את הרכבה בינונית עד יבש, מעדיפים לילה, בסביבה קריר ואפל.

7. מיקרוסקופ

1. סעיפים היסטולוגית מוכנים להתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בניסוי זה, השתמשנו מיקרוסקופ BX51 אולימפוס מצוידים משולשת (FitC: MCA טקסס האדום) לסנן. מסגרת התמונה תוכנה (MicroFire, Goleta, קליפורניה) היה בשימוש.

8. נציג תוצאות:

כיוון אוטומטי של הקרינה ברקמות הדג הוא גבוה כל כך, רקמות אלה יופיעו תפוז תחת Tri-מסנן, בנוחות מתן רקע החיידק.

על רקע זה, חיידקים בודדים מוכתם FitC יופיעו כנקודות ירוק בהיר, ב 200X צורה מוט שלהם יהיה ניתן לזיהוי (איור 1).

קטעים רעים יכולים להוות כוזב חיובי (עקב בעיה בשלב השטיפה), ובמקרה זה מספר גדול של חיידקים יופיעו להיות נוכח באופן אחיד בשקופית.

באיור 1. מיקרוסקופ של שרירים חלקים מראה שתי E. ictaluri (חצים A ו-B) (200x).

igure 2 "/>
איור 2. תכנית כוללת של הניסוי

Discussion

זה פרוטוקול פרטים טכניקה של הדמיית באתרו של הפתוגן שפמנון Edwardsiella ictaluri בסעיפים היסטולוגית. למיטב ידיעתנו, זהו פרוטוקול כזה הראשון שתיאר.

השלב הקריטי ביותר, שעל פי ניסיוננו, היא שטיפה של נוגדנים כפי שמתואר בשלב 4.4 של הפרוטוקול הנוכחי כמו שטיפה לא מספקת עלולה לגרום חיובי כוזב.

הבעיה העיקרית עם לפרש את התוצאות של הטכניקה הזו הוא פלואורסצנציה אוטומטי של הרקמה. עם זאת, נמצא כי שימוש Tri-מסנן פתרה בעיקר כי הבעיה כמו הרוב המכריע של הקרינה הלא ספציפית מתרחשים מחוץ הספקטרום פלואורסצנטי ירוק. כמו כן, בעוד טכניקה זו היא רגישה מאוד, זה יכול מצליחים לזהות המון חיידקים נמוכה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Infusion broth	BD Biosciences	237200
MS222	Argent Labs
Whole mouse Serum	Cappel	55989
Goat anti-mouse FitC	SouthernBiotech	1010-04
Permafluor	Lab Vision	Ta-030-FM
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P-4504
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100-6X500ML
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	85040C
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P-5379
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S-5761
Sodium chloride (NaCal)	Sigma-Aldrich	S-9625
Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S-9390