Summary
Умирающие клетки выдавливается из эпителиальной ткани согласованные сокращения соседние клетки, не нарушая барьерную функцию. Оптической прозрачности развития данио обеспечивает отличная система для визуализации экструзии в живых эпителия. Здесь мы опишем методы, чтобы вызвать и изображения экструзии в личиночной эпидермиса данио на клеточном разрешения.
Abstract
Гомеостатические поддержания эпителиальных тканей требует постоянного удаления поврежденных клеток, не нарушая барьерную функцию. Наши исследования показали, что умирающие клетки посылают сигналы в их живых соседей, чтобы форма и контракт кольцо актина и миозина, что выбрасывает его из эпителиальных листа при закрытии каких-либо пробелов, которые могут быть результатом его выход, и этот процесс называется ячейка экструзии 1. Оптической прозрачности развития данио обеспечивает отличная система для визуализации экструзии в живых эпителия. Здесь мы опишем метод, чтобы побудить и изображения экструзии в личиночной эпидермиса рыбок данио. Для визуализации экструзии, мы вводим красный флуоресцентный белок меченного зонда для F-актина в одно-клеточной стадии трансгенных эмбрионов данио выражения зеленого флуоресцентного белка в эпидермис и вызывать апоптоз путем добавления G418 для личинок. Затем с помощью покадровой изображения на вращающийся диск конфокальной микроскопии для наблюдения динамики актина и эпителиальных поведения клетка в процессе апоптоза клетка экструзии. Такой подход позволяет исследовать процесс экструзии в живых эпителия и будет предоставлять проспект изучать болезненных состояний, вызванных неустранения апоптоза клеток.
Protocol
Основные Workflow для визуализации актиновых динамика в процессе клеточного Экструзия в Эпидермис развивающихся данио рерио
Эпидермис развивающихся данио состоит из двух отдельных слоев, поверхностный слой (или перидермы) и базального слоя клеток, что контакт базальной мембраны 2. Клетки наружного слоя поверхности претерпевают апоптоз и устраняются из ткани методом экструзии 3 (рис. 1). Чтобы представить себе этот процесс в реальном времени, мы вводим РНК кодирования красного флуоресцентного белка, слитого с домена calponin гомологии атрофин, связывающий белок актин (RFP-UtrCH) 4,5, в одно-клеточной стадии трансгенных данио выразив зеленый флуоресцентный белок (GFP ) в стратифицированной промоутер эпителия цитокератин 8 6 (рис. 2А). Хотя RFP-UtrCH является повсеместно выражается в животных после инъекции РНК, мы ориентируемся на поверхностные клетки эпидермиса, которые выражают как ППП и GFP следовать динамику актина в частности, в эпидермис (рис. 2В). Мы тогда лечить личинок с G418, чтобы побудить апоптоза клеток и экструзии изображение эпидермиса и актиновых филаментов использованием вращающегося диска конфокальной микроскопии и приобрести 4D наборов данных.
До начала эксперимента
- В пробирке транскрипции РНК из линеаризованной ДНК с использованием шаблона mMessage mMachine SP6 комплект (Амбион) и очистить ограничен РНК с использованием RNeasy Мини комплект (Qiagen). Развести РНК ~ 60ng/ul использованием стерильной водой, сделать 3-5 мкл аликвоты и хранят при температуре -80 ° С до готовности для инъекций. Примечание: Избегать повторного замораживания / оттаивания, чтобы предотвратить деградацию РНК.
- Сделать плесень провести эмбрионы во время инъекции, поливая 40 мл 2% агарозном в E3 среда эмбриона (E3) в 100 х 15 мм культуры пластины и размещения микроинъекции плесень (адаптивная науки Инструменты, # I-34) в этот лоток. После агарозном укрепил, удалить плесень подвергать корыта в агарозы. Храните пластины при температуре 4 ° С до готовности к использованию.
- Вытяните капиллярных игл для инъекций применяют боросиликатного стекла с нитями (OD 1,0 мм, ID 0,78, 10 см длиной) и Саттер Р-97 Съемник Внесите в следующие настройки (Heat 485, Pull 50, скорость 60, Delay / Время 90, давление 200 ). Примечание: Различные виды стекла потребует оптимизации перечисленных условий.
- Макияж 1% Низкая расплава (LM) агарозы в Е3 и хранить 1 мл аликвоты при 42 ° C. Будьте осторожны, поскольку испарение E3 от акций может увеличиться концентрация агарозы.
- Поддерживать взрослых данио в стандартных лабораторных условиях, с регулярными светлый / темный цикл 14 часов света и 10 часов темноты 7. В ночь перед экспериментом создали рыбу к спариванию, разместив 3 женщины и 2 мужчин в бак, разделенных перегородками. Следующим утром, менять воду в аквариуме и потяните разделитель, когда свет включается.
1. Инъекция РНК Кодирование флуоресцентно меткой связывающий белок актин
- Оттепель РНК на льду. Добавить 0,5% фенола красного к РНК в соотношении 1:1 для конечной концентрации РНК ~ 30ng/μl и нагрузки 1 мкл раствора в капиллярной вытащил иглу обратно заполнения.
- Сбор 1 ~ 75-клеточной стадии 8 CK: GFP эмбрионов в Е3. Внесите собраны эмбрионов в микроинъекции формы с 5 ¾ Пастера пипетки и мягко ориентировать эмбрионов в корыто с ФСТ Дюмон # 5 щипцами. Примечание: Будьте осторожны, чтобы работать быстро, чтобы избежать инъекционного в мульти-клеточной стадии эмбриона, которые могут привести к мозаике выражение вводили РНК.
- Под стандартным лабораторным рассекает стереомикроскопа, вводить РНК в желток эмбрионов использованием давления контролируемой microinjector (Harvard Аппарат PLI-100 Pico-инжектор). Красное пятно (фенол красный) должны быть видны в эмбрион после инъекции. Inject по крайней мере 50 эмбрионов для каждого эксперимента. (См. предыдущий протокол Юпитера для подробный протокол на РНК инъекции в эмбрионы рыбок данио 9). Примечание:
- Объемом ~ 2nl должен быть использован для инъекции РНК в одно-клеточных эмбрионов стадии. Чтобы определить количество РНК вводили, отпускать болюс РНК в капле минерального масла на калиброванных микрометра слайд или под микроскопом со шкалой бар встроен в окуляры. Капли РНК должна быть идеальная сфера. Рассчитать сумму выступил по следующей формуле: Объем (в п) = 4/3πr 3. Регулировка громкости доставлен путем изменения давления впрыска или времени на инструменте.
- Следует также принять меры для введения низкое количество РНК, которая позволяет визуализировать флуорофора, так как высокие концентрации РНК могут быть токсичными для развивающегося эмбриона. Чтобы определить соответствующий уровень выражения, доза-кривой эксперимента должны быть выполнены перед запуском эксперимента. </ LI>
- Сортировать эмбрионов, чтобы удалить неоплодотворенные яйца или поврежденные и поставить все оставшиеся эмбрионы на 28,5 ° C.
- После 24 часов использования флуоресцентного микроскопа рассекает для выбора эмбрионов данио рерио, у которых есть высокий уровень GFP (эпидермиса) и RFP (актин) флуоресценции. Поместите выбранный эмбрионов на 28,5 ° С до готовности приступить к лечению, чтобы вызвать апоптоз.
2. Индукция сотовый Экструзия в данио рерио Личинки использованием G418
Мы обнаружили, что воздействие антибиотиков аминогликозидов G418 или Генетицин, вызывает апоптоз и экструзии клеток эпидермиса в развитии личинки данио 3 с помощью неизвестного механизма. Важно, что это лечение работает только на личинки, которые 4 дня после оплодотворения и старше. Мы находим, что ~ 5-25 клетки могут быть найдены экструзии в любой момент времени из плавника эпителиальных из G418 рассматриваются личиночной рыбок данио. Так как количество апоптотических экструзии клетки могут варьироваться от рыбы к рыбе, мы рекомендуем монтаж нескольких рыб для работы с изображениями.
- Сбор и место 4-й день после оплодотворения (DPF), данио личинки выставке как GFP и RFP флуоресценции в 35 х 10 мм блюдо культуры, содержащий 3 мл (MLS) Е3. Можно лечить до 25 личинок в это блюдо культуры размера.
- Тщательно заменить сред с 3mLs Е3 содержащие 1mg/mL из G418 и инкубировать личинок наркотиков в течение 4 часов при 28,5 ° C. Обратите внимание, что G418 является светочувствительным, поэтому позаботьтесь, чтобы сохранить культуру блюдо покрытием или в темноте.
- Удалить СМИ и заменить подогретого 28,5 ° C СМИ E3 содержащей 0,02% Tricaine и приступить к установке личинок.
3. Монтаж данио рерио Личинки для работы с изображениями
- Передача 3 личинок 1,5 мл трубки Эппендорфа и удалить большую часть E3 после рыбы опускаются на дно трубы. Мы обнаружили, что до 3-х животных может быть правильно смонтированы перед агарозном затвердевает.
- Использование порогового кончика пипетки, пипетки 120ul 1% LM-агарозы (42 ° С) в пробирку, перемешайте, а затем осторожно пипеткой личинок и агарозном смесь на покровного стекла в нижней части блюда культуры Маттек.
- Использование ФСТ контактный держатель штифт вставить или вольфрамовой иглой, быстро ориентироваться личинки, таким образом они являются прямыми и плоскими против покровного стекла на блюдо Маттек.
Примечание: Обычно мы используем прямой контактный сначала ориентироваться личинки, а затем Г-образный штифт, чтобы они были плоскими против покровного стекла, не допуская повреждения образцов. - После агарозном укрепил, аккуратно заполните блюдо с E3 содержащей 0,02% Tricaine. Примечание: Кроме того, G418 может быть добавлен к E3 в визуализации блюдо продолжать вызывать экструзии, хотя длительное воздействие на 1mg/mL G418 убьет личинок.
4. Живая изображений актина Динамика и индивидуальных Эпителиальные поведения клеток при использовании сотового Экструзия вращающийся диск конфокальной микроскопии
Мы обнаружили, что весь процесс апоптоза клеток из экструзионного эпидермиса развития личинки данио занимает приблизительно 20 минут 3. Здесь показано, как настроить покадровой визуализации эксперимент, чтобы собирать серию плоскостей г через один слой эпидермиса данио для визуализации процесса экструзии. Мы обнаружили, что типичный широкопольных флуоресцентных микроскопов привести к значительным фотообесцвечивания актиновых филаментов и не позволяют timelapse изображений. Таким образом, чтобы максимизировать нашу резолюцию и не допустить фотообесцвечивания, мы используем вращающийся диск конфокальной микроскопии. Ниже мы опишем, как настроить эксперимент с использованием программного обеспечения Андор IQ с помощью микроскопа Nikon, хотя принципы, обсуждаемые могут быть применены к аналогичным микроскопом настроек.
- Во-первых, включить Аргон (для возбуждения GFP при 488nm) и гелий-неонового (для возбуждения RFP на 561nm) лазеры, микроскоп, фотоаппарат и epifluorescent лампы.
- В Андор IQ программного обеспечения (версия 1.10.1), создать протокол временных рядов содержащие длин волн вы хотите, чтобы изображения, частота интервалы между образом захватывает и количество раз захват должен быть повторен.
- Аккуратно блюдо Маттек содержащий образец на предметный столик микроскопа и использовать 20-кратным объективом с проходящего света, чтобы сосредоточиться на личинок.
- Перемещение 40X цель погружением в воду (NA 0.8) в правильном положении. Использование этой цели, мы можем фильма примерно 20-25 клеток на поле, что позволяет проследить сотовой поведения в процессе экструзии в то же время решение субклеточном динамики актина. Обратите внимание: тот же монтаж и визуализации стратегии могут быть применены к вертикально микроскопы, хотя 40X цель погружением в воду с большим рабочим расстоянием должны быть использованы.
- Осторожно поместите каплю воды на начало 40х объективных и быстро поместить блюдо Маттек на вершине. Нее: Zeiss Immersol погружения решение также может быть использована, если испарение воды является проблемой.
- Определить образец использования фазы или DIC освещения, а затем использовать 488nm epifluorescence сосредоточиться конкретно на GFP положительные эпидермиса.
- Переключение в режим конфокальной сканирования. Отрегулируйте интенсивность лазера и время экспозиции для каждого из каналов (488nm и 561nm) соответственно. Позаботьтесь, чтобы сбалансировать мощности лазера и времени воздействия для оптимального обнаружения ваш сигнал и для предотвращения всякого фотообесцвечивания или токсичности.
- Чтобы определить экструзии клетки, используйте epifluorescence визуализировать GFP помечены эпидермиса и определить группу ячеек в классической схеме розетка, состоящая из набора клеток, окружающих маленький круглый ячейку в середине. Использование конфокальной режим сканирования, не должно быть также накопление РФП меченных актина видны как кольцо вокруг маленькие круглые ячейки в середине, отличительной чертой клеточной экструзии. После того как вы определили экструзии клетку, быстро настроить микроскоп, чтобы приобрести 4D (XYZ-Time) конфокальной наборов данных.
- Установите верхние и нижние точки в плоскости г для визуализации одного слоя эпидермиса, в том числе выдавливания клетки, и выберите размер шага. Для покадровой обработки изображений, установить интервалы для создания изображений и количество повторений. Например, мы обычно приобретают Z-серия охватывает 5-10 мкм, с 1 мкм, размер шага, через каждые 1-2 минут в течение 30 минут.
- Для просмотра данных, которые мы обычно делают 3-D проекции серии Z и сохранить набор данных в виде фильма файл, совместимый с Quick Time (Apple). Таким образом, мы можем представить себе сокращение кольцо актина и эпителиальных поведения, которые происходят вокруг умирающей клетка с течением времени.
5. Представитель Результаты
Рисунок 1. Схема апоптоза экструзии клетки. Актиновых филаментов отображаются красным цветом, GFP положительные клетки эпидермиса зеленые.
Рисунок 2. Экспериментальные Workflow. А. Схема рабочего процесса для эксперимента. B. Выражение RFP-UtrCH в эпидермисе 4dpf CK: GFP рыбок данио.
Рисунок 3. Кадры (г-проекции) из покадровой фильм, который следует жить актина динамики в процессе экструзии эпителиальные клетки. Стрелки обозначают кольцо актина образованный соседними клетками, какие контракты и закрывается в течение 2 минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, демонстрирует простой и прямой способ для визуализации процесса экструзии в живых эпителиальной ткани. Такого рода эксперимент позволяет нам изучить тонкости актина динамики не ранее оценил в основной анализ ткани, и, следовательно, дополняет общую иммунофлуоресцентного методами. Мы можем использовать этот протокол в сочетании с химическими ингибиторами или генетических мутантов, чтобы лучше анализировать процесс экструзии и государств исследовании болезней, связанных с провалом для удаления, и ясно апоптоза клеток, которые мы ожидаем, что приведет к воспалительным реакциям или накопление поврежденных клеток, а видели в рак. Например, нашей лаборатории ранее показали, что химические ингибиторы могут быть использованы в сочетании с G418 для изменения ориентации актиновых нитей вдоль базолатеральной поверхности клетки, которая эффекты направлении клетка экструдирует 3. Одним из ограничений для текущего метода является то, что из-за стохастического и непредсказуемый характер гибели клеток, наши наборы данных имеют тенденцию сосредотачиваться на более поздних стадиях экструзии. Для изучения формирования многоклеточных кольцо актина и начало сокращения, будущие эксперименты будут применяться методы индуцируют апоптоз в подмножество флуоресцентно меченных эпителиальных клеток, которые генетически предназначена для клеточной гибели 10. Сочетание этой стратегии с помощью нашего метода для изображения динамики актина в эпидермисе должна способствовать изучению ранних шагов, ведущих к апоптозу экструзии клетки. Вместе информации, полученной от этих экспериментов будет существенным дополнением в нашем понимании эпителиальных экструзии клетки и ее медицинское значение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Обеспечение защиты животных
Все процедуры, проводимые в этом протокол, используя данио рерио, данио rerio, были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) в университете штата Юта (животных Обеспечение # 10-07017).
Acknowledgments
Мы благодарим членов лаборатории Розенблатт для научных дискуссий, предложения и замечания. Мы также хотели бы поблагодарить Марию Халлоран который любезно предоставил плазмиды, кодирующей RFP-UtrCH и Дэвид Грюнвальд, которые предоставили CK: GFP трансгенных данио. Спасибо также Гретхен Король и сотрудниками централизованных ресурсов данио рерио в Университете штата Юта, за отличное обслуживание и уход за рыбок данио. Работа выполнена при поддержке нью-Новатор NIH-NIGMS NIH директора премии 1 DP2 OD002056-01 для JR. ГТД была поддержана NIH многопрофильная рака Программа обучения Грант 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
