Summary
मर कोशिकाओं उपकला ऊतकों से पड़ोसी की कोशिकाओं के ठोस संकुचन द्वारा बाधा समारोह में खलल न डालें बिना extruded कर रहे हैं. zebrafish के विकास के ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए एक उत्कृष्ट epithelia में रहने वाले बाहर निकालना कल्पना प्रणाली प्रदान करता है. यहाँ हम विधियों का वर्णन करने के लिए प्रेरित और सेलुलर संकल्प पर लार्वा zebrafish epidermis में छवि बाहर निकालना.
Abstract
उपकला ऊतकों की homeostatic रखरखाव क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की बाधा समारोह में खलल न डालें बिना नित्य हटाने की आवश्यकता है. हमारे अध्ययन ने पाया है कि उनके रहने पड़ोसियों के लिए मर कोशिकाओं संकेतों को भेजने के लिए फार्म और actin और मायोसिन की एक अंगूठी है कि यह ejects उपकला पत्रक से बाहर करते हुए किसी भी अंतर है कि इसके बाहर से परिणाम हो सकता है है बंद अनुबंध, एक प्रक्रिया कोशिका 1 बाहर निकालना करार दिया. zebrafish के विकास के ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए एक उत्कृष्ट epithelia में रहने वाले बाहर निकालना कल्पना प्रणाली प्रदान करता है. यहाँ हम एक विधि का वर्णन करने के लिए प्रेरित और लार्वा zebrafish epidermis में छवि बाहर निकालना. बाहर निकालना कल्पना करने के लिए, हम एफ actin के लिए एक सेल चरण ट्रांसजेनिक zebrafish epidermis में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त भ्रूण में एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल जांच और इंजेक्षन G418 के लार्वा के अलावा द्वारा apoptosis प्रेरित. हम तो एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन पर समय चूक इमेजिंग उपयोग apoptotic सेल बाहर निकालना की प्रक्रिया के दौरान actin गतिशीलता और उपकला कोशिका व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए. यह दृष्टिकोण हमें जीना epithelia में बाहर निकालना प्रक्रिया की जांच करने के लिए अनुमति देता है और रोग apoptotic कोशिकाओं को खत्म करने की विफलता की वजह से राज्यों को अध्ययन के लिए एक अवसर प्रदान करेगा.
Protocol
विकास Zebrafish के epidermis में सेल एक्सट्रूज़न के दौरान actin गतिशीलता के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए मूल वर्कफ़्लो
विकासशील zebrafish के दो अलग परतों, सतह परत और (या periderm) कोशिकाओं है कि तहखाने 2 झिल्ली संपर्क की एक बेसल परत के epidermis शामिल है. बाहरी सतह परत की कोशिकाओं apoptosis से गुजरना और 3 बाहर निकालना (चित्रा 1) से ऊतक से सफाया. वास्तविक समय में इस प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए, हम शाही सेना एन्कोडिंग लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक सेल चरण ट्रांसजेनिक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP व्यक्त zebrafish में utrophin, एक actin बाध्यकारी प्रोटीन (आरएफपी UtrCH) 4,5, calponin अनुरूपता डोमेन इनकार इंजेक्षन ) स्तरीकृत epithelia प्रमोटर 8 cytokeratin 6 (2A चित्रा) के तहत . हालांकि आरएफपी - UtrCH सर्वत्र आरएनए इंजेक्शन के बाद जानवर में व्यक्त किया है, हम सतही epidermal कोशिकाओं है कि दोनों आरएफपी और GFP actin गतिशीलता का पालन करें epidermis (चित्रा 2B) में विशेष रूप से व्यक्त पर ध्यान केंद्रित. हम तो G418 के साथ लार्वा को apoptotic सेल से बाहर निकालना और छवि epidermis और actin filaments के एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन का उपयोग प्रेरित और 4D डेटासेट अधिग्रहण का इलाज.
पहले प्रयोग शुरू
- में इन विट्रो mMessage mMachine SP6 किट (Ambion) का उपयोग एक linearized डीएनए टेम्पलेट से शाही सेना नक़ल करना और छाया शाही सेना RNeasy मिनी किट (Qiagen) का उपयोग कर शुद्ध. ~ 60ng/ul शाही सेना पतला बाँझ पानी का उपयोग, इंजेक्शन के लिए तैयार है जब तक 3 5μl aliquots और -80 पर दुकान ° सी बनाते हैं. नोट: दोहराव फ्रीज / शाही सेना की गिरावट को रोकने के विगलन से बचें.
- इंजेक्शन के दौरान E3 भ्रूण मध्यम (E3) में 2% agarose के 40ml और एक 100 x 15mm संस्कृति की थाली में डालने के लिये इस ट्रे में एक microinjection मोल्ड (अनुकूली विज्ञान उपकरण, # मैं -34) रखने के द्वारा भ्रूण पकड़ मोल्ड बनाओ. एक बार agarose जम गया है, agarose में troughs बेनकाब मोल्ड को हटा दें. 4 ° जब तक सी उपयोग के लिए तैयार की थाली स्टोर.
- (आयुध डिपो 1.0mm, 0.78 आईडी, 10cm लंबाई) filaments और एक Sutter P-97 निम्नलिखित सेटिंग्स (हीट 485, 50 खींचो, 60 वेग, देरी / समय 90, 200 दबाव में पिपेट डांड़ी के साथ borosilicate ग्लास का उपयोग इंजेक्शन के लिए केशिका सुइयों खींचो ). नोट: कांच के विभिन्न प्रकार के रूप में सूचीबद्ध शर्तों के अनुकूलन की आवश्यकता होगी.
- 1% कम पिगलो (एल एम) 42 पर E3 और दुकान 1ml aliquots में agarose डिग्री सेल्सियस सावधान रहो के रूप में E3 के शेयरों से वाष्पीकरण agarose एकाग्रता में वृद्धि कर सकते हैं.
- मानक प्रयोगशाला परिस्थितियों में एक नियमित रूप से प्रकाश / 14 घंटे प्रकाश और अंधेरे के 7 10 घंटे के अंधेरे चक्र के साथ वयस्क zebrafish बनाए रखें. रात से पहले प्रयोग एक विभक्त द्वारा अलग टैंक में 3 महिला और दो पुरुषों रखकर दोस्त मछली सेट. अगली सुबह, टैंक में पानी को बदलने के लिए और विभक्त खींच जब रोशनी पर आते हैं.
1. शाही सेना के इंजेक्शन fluorescently टैग actin बाइंडिंग प्रोटीन इनकोडिंग
- बर्फ पर शाही सेना का पहले गला लें. ~ 30ng/μl के अंतिम शाही सेना एकाग्रता के लिए एक 1:1 अनुपात में शाही सेना के लिए 0.5% Phenol लाल जोड़ें खींच केशिका सुई में वापस भरने के द्वारा 1μl समाधान लोड.
- लीजिए ~ 75 1 सेल चरण 8 सी.के.: E3 में GFP भ्रूण. Pipet microinjection मोल्ड में भ्रूण के साथ एक 5 ¾ एकत्र पाश्चर pipet और धीरे पूरबी FST Dumont # 5 संदंश के साथ गर्त में भ्रूण. नोट: ध्यान रखना करने के लिए जल्दी से काम के रूप में एक मंच बहु सेल भ्रूण है, जो इंजेक्शन शाही सेना के मोज़ेक अभिव्यक्ति में परिणाम कर सकते में इंजेक्शन से बचने के लिए.
- एक मानक प्रयोगशाला विदारक stereomicroscope के तहत, दबाव नियंत्रित microinjector (हार्वर्ड उपकरण पीएलआई-100 पिको इंजेक्टर) का उपयोग भ्रूण के जर्दी में शाही सेना इंजेक्षन. एक लाल स्पॉट (phenol लाल) भ्रूण में दिखाई इंजेक्शन के बाद किया जाना चाहिए. प्रत्येक प्रयोग के लिए कम से कम 50 भ्रूण इंजेक्षन. (Zebrafish 9 भ्रूण में शाही सेना इंजेक्शन पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए पिछले जौव प्रोटोकॉल देखें) . नोट:
- 2nl ~ का एक मात्रा एक सेल चरण भ्रूण में शाही सेना के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इंजेक्शन शाही सेना की राशि का निर्धारण करने के लिए, या पैमाने eyepieces में बनाया पट्टी के साथ एक खुर्दबीन के नीचे एक calibrated सुक्ष्ममापी स्लाइड पर खनिज तेल की एक बूंद में शाही सेना के एक सांस में बांटना. शाही सेना की छोटी बूंद एक आदर्श क्षेत्र होना चाहिए. (Nl) में वॉल्यूम = 3 4/3πr: समीकरण का उपयोग करके वितरित राशि की गणना . इंजेक्शन या साधन पर दबाव समय बदलकर दिया मात्रा समायोजित करें.
- केयर भी शाही सेना के कम राशि है कि अनुमति देता है की fluorophore दृश्य इंजेक्षन करने के लिए, के रूप में शाही सेना के उच्च सांद्रता विकासशील भ्रूण को विषाक्त किया जा सकता है लिया जाना चाहिए. उचित अभिव्यक्ति के स्तर निर्धारित करने के लिए, एक खुराक वक्र प्रयोग से पहले प्रयोग चल रहा है प्रदर्शन किया जाना चाहिए. </ Li>
- भ्रूण के आधार पर क्रमबद्ध किसी भी unfertilized या क्षतिग्रस्त अंडे निकालने के लिए और 28.5 पर सभी शेष भ्रूण जगह डिग्री सेल्सियस
- 24 घंटे के बाद, एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन विदारक का उपयोग करने के लिए zebrafish भ्रूण कि GFP (epidermis) और आरएफपी प्रतिदीप्ति (actin) के एक उच्च स्तर का चयन करें. 28.5 पर चयनित भ्रूण प्लेस डिग्री सेल्सियस तक दवा को apoptosis प्रेरित उपचार के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार है.
2. सेल एक्सट्रूज़न Zebrafish G418 का उपयोग लार्वा में प्रेरण
हमने पाया है कि aminoglycoside एंटीबायोटिक G418, या Geneticin, जोखिम और एक अज्ञात तंत्र द्वारा zebrafish 3 लार्वा के विकास में epidermal कोशिकाओं के बाहर निकालना apoptosis का कारण बनता है. महत्वपूर्ण बात, इस इलाज केवल लार्वा कि 4 दिनों के बाद निषेचन और पुराने हैं पर काम करता है. हम पाते हैं कि ~ 5-25 कोशिकाओं G418 इलाज लार्वा zebrafish के उपकला पंख से किसी भी समय extruding पाया जा सकता है. Apoptotic extruding कोशिकाओं की राशि के रूप में मछली से मछली के लिए भिन्न हो सकते हैं, हम इमेजिंग के लिए कई मछली बढ़ते सलाह देते हैं.
- लीजिए और 4 दिन के बाद (DPF) zebrafish लार्वा एक 35 x 10mm संस्कृति E3 के 3 मिलीलीटर (MLS) युक्त पकवान में दोनों GFP और आरएफपी प्रतिदीप्ति प्रदर्शन निषेचन जगह. एक इस आकार संस्कृति डिश में 25 लार्वा का इलाज कर सकते हैं.
- ध्यान से दवा में 4 घंटे के लिए G418 और सेते लार्वा के E3 युक्त 1mg/mL 3mLs के साथ 28.5 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया की जगह ध्यान दें कि G418 संवेदनशील प्रकाश है, तो देखभाल करने के लिए संस्कृति डिश को कवर या अंधेरे में रखने.
- मीडिया निकालें और पूर्व गर्म 28.5 डिग्री सेल्सियस E3 0.02% Tricaine युक्त मीडिया के साथ की जगह है और लार्वा बढ़ते के लिए आगे बढ़ना.
3. इमेजिंग के लिए बढ़ते Zebrafish लार्वा
- एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब 3 लार्वा स्थानांतरण और मछली ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक के बाद E3 के सबसे हटायें. हमने पाया है कि 3 पशुओं को ठीक होने से पहले agarose solidifies रखा जा सकता है.
- Coverglass पर एक MatTek संस्कृति डिश के तल में एक कट pipet टिप, 1% LM agarose (42 डिग्री सेल्सियस) के ट्यूब में pipet 120ul, मिश्रण, और फिर धीरे pipet लार्वा और agarose मिश्रण का उपयोग.
- एक डालने पिन या टंगस्टन संलग्न सुई, जल्दी पूरबी लार्वा ताकि वे MatTek पकवान की coverglass के खिलाफ सीधे और सपाट हैं के साथ एक FST पिन धारक का उपयोग करना.
नोट: हम आम तौर पर पहली पूरबी लार्वा और फिर एक एल के आकार पिन के लिए एक सीधे पिन का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे coverglass के खिलाफ फ्लैट हैं जबकि नमूनों के लिए नुकसान को रोकने. - एक बार agarose जम गया है, धीरे E3 Tricaine 0.02% युक्त के साथ पकवान भरने. नोट: वैकल्पिक रूप से, G418 इमेजिंग के लिए उत्प्रेरण बाहर निकालना जारी रखने के पकवान में E3 के लिए जोड़ा जा सकता है, हालांकि 1mg/mL G418 के लिए लंबी अवधि के जोखिम लार्वा मार देगा.
4. सेल एक्सट्रूज़न actin गतिशीलता और व्यक्तिगत उपकला सेल व्यवहार की इमेजिंग के दौरान एक स्पिनिंग डिस्क confocal खुर्दबीन का उपयोग कर Live
हमने पाया है कि zebrafish लार्वा के विकास के epidermis से apoptotic सेल बाहर निकालना की पूरी प्रक्रिया में लगभग 20 3 मिनट लगते हैं. यहाँ हम प्रदर्शन कैसे सेटअप करने के लिए एक इमेजिंग समय चूक प्रयोग zebrafish epidermis की एक परत के माध्यम से z विमानों की एक श्रृंखला लेने के लिए बाहर निकालना प्रक्रिया कल्पना. हमने पाया है कि ठेठ widefield फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शी actin filaments के महत्वपूर्ण photobleaching और timelapse इमेजिंग के लिए अनुमति नहीं है कारण. इसलिए, हमारे संकल्प को अधिकतम करने के लिए और photobleaching को रोकने के, हम एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन का उपयोग करें. नीचे हम वर्णन कैसे प्रयोग एक Nikon खुर्दबीन के साथ Andor बुद्धि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्थापित करने के लिए, हालांकि चर्चा सिद्धांतों इसी तरह खुर्दबीन सेट - अप करने के लिए लागू किया जा सकता है.
- सबसे पहले, आर्गन (GFP 488nm पर उत्तेजना के लिए) और (आरएफपी 561nm पर उत्तेजना के लिए) लेज़रों, माइक्रोस्कोप, कैमरा, और epifluorescent दीपक HeNe पर बारी.
- Andor बुद्धि सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.10.1) के भीतर, एक समय श्रृंखला प्रोटोकॉल छवि के लिए तरंगदैर्य आप चाहते युक्त बनाने के लिए, छवि captures और संख्या समय के बीच अंतराल की आवृत्ति पर कब्जा दोहराया जाना चाहिए.
- धीरे MatTek खुर्दबीन मंच पर अपने नमूना युक्त पकवान जगह और संचारित प्रकाश के साथ एक 20x उद्देश्य का उपयोग करने के लार्वा पर ध्यान केंद्रित.
- 40x पानी विसर्जन उद्देश्य (0.8 एनए) को सही स्थिति में ले जाएँ. इस उद्देश्य का उपयोग करना, हम प्रति क्षेत्र है, जो हमें बाहर निकालना के दौरान सेलुलर व्यवहार का पालन करते हुए भी उप सेलुलर actin गतिशीलता को हल करने की अनुमति देता है लगभग 20-25 कोशिकाओं फिल्म कर सकते हैं. नोट: एक ही बढ़ते है और इमेजिंग रणनीतियों ईमानदार सूक्ष्मदर्शी के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि एक लंबे समय तक काम दूरी के साथ एक 40x पानी विसर्जन उद्देश्य इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- ध्यान 40x उद्देश्य के शीर्ष पर पानी की एक बूंद जगह है और जल्दी शीर्ष पर MatTek पकवान जगह. नहींई: Zeiss Immersol विसर्जन समाधान भी यदि पानी के वाष्पीकरण में एक समस्या है इस्तेमाल किया जा सकता है.
- चरण या डीआईसी रोशनी का उपयोग नमूना पहचानें और फिर 488nm epifluorescence का उपयोग करने के लिए GFP सकारात्मक epidermis पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित.
- Confocal स्कैनिंग मोड के लिए स्विच. लेजर की तीव्रता और चैनलों में से प्रत्येक के लिए जोखिम समय (और 561nm 488nm) तदनुसार समायोजित करें. ध्यान रखना करने के लिए अपने संकेत का इष्टतम पता लगाने के लिए लेजर शक्ति और जोखिम के समय संतुलन और किसी भी photobleaching या विषाक्तता को रोकने के.
- Extruding कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, epifluorescence का उपयोग करने के लिए कल्पना GFP लेबल epidermis और एक क्लासिक थाली पैटर्न में कोशिकाओं का एक समूह की पहचान, बीच में एक छोटा सा दौर सेल कोशिकाओं के आसपास के एक संग्रह के निर्वाचकगण. Confocal स्कैनिंग मोड का उपयोग करना है, वहाँ भी आरएफपी लेबल बीच में छोटे दौर सेल, सेल बाहर निकालना के एक बानगी के चारों ओर एक अंगूठी के रूप में दिखाई actin के एक संग्रह होना चाहिए. एक बार जब आप एक extruding सेल की पहचान की है, जल्दी खुर्दबीन 4D (XYZ समय) confocal डेटासेट के अधिग्रहण की स्थापना की.
- Z विमान के भीतर ऊपरी और निचले अंक सेट epidermis की एक परत extruding सेल सहित, कल्पना, और कदम आकार का चयन करें. समय चूक के लिए इमेजिंग, और repetitions की छवि पर कब्जा संख्या के लिए अंतराल सेट. उदाहरण के लिए, हम आम तौर पर एक 1 सुक्ष्ममापी कदम आकार, 30 मिनट के लिए हर 1-2 मिनट के साथ एक 5-10μm, फैले z-श्रृंखला का अधिग्रहण.
- डेटा देखने के लिए, हम आम तौर पर z श्रृंखला के 3 - डी के अनुमानों बनाने और एक फिल्म फ़ाइल है कि त्वरित समय (एप्पल) के साथ संगत है के रूप में सेट डेटा को बचाने. इस तरीके में, हम actin अंगूठी और उपकला व्यवहार है कि समय के साथ मर सेल के आसपास होने के संकुचन की कल्पना कर सकते हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 apoptotic सेल बाहर निकालना के योजनाबद्ध. Actin filaments लाल रंग में दिखाया जाता है, GFP सकारात्मक epidermal कोशिकाओं को हरा कर रहे हैं.
चित्रा 2. प्रायोगिक कार्यप्रवाह. प्रयोग के लिए वर्कफ़्लो ए योजनाबद्ध बी. GFP zebrafish: आरएफपी - UtrCH के एक 4dpf सी.के. के epidermis में अभिव्यक्ति.
चित्रा 3 अभी भी एक फिल्म समय चूक है कि उपकला कोशिका बाहर निकालना प्रक्रिया के दौरान रहते actin गतिशीलता इस प्रकार से फ्रेम (z-अनुमानों ). तीर actin की अंगूठी जो अनुबंध और 2 मिनट के पाठ्यक्रम पर बंद पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा गठित निरूपित.
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Discussion
यहाँ वर्णित एक सरल और सीधा एक जीवित उपकला ऊतक में बाहर निकालना की प्रक्रिया कल्पना विधि प्रोटोकॉल को दर्शाता है. प्रयोग के इस प्रकार हमें actin गतिशीलता निर्धारित ऊतक विश्लेषण में पहले नहीं की सराहना की बारीकियों की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और इसलिए, आम immunofluorescent तरीकों पूरक. हम रासायनिक inhibitors या आनुवंशिक म्यूटेंट के साथ संयोजन में इस प्रोटोकॉल के लिए बेहतर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के संचय के लिए नेतृत्व करेंगे बाहर निकालना प्रक्रिया और apoptotic कोशिकाओं है, जो हम उम्मीद को हटाने और स्पष्ट विफलता के साथ जुड़े अध्ययन रोग राज्यों का विश्लेषण का उपयोग कर सकते हैं, के रूप में कैंसर में देखा. उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला पहले दिखाया गया है कि रासायनिक inhibitors G418 के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है सेल के basolateral सतह है, जो दिशा में एक सेल 3 extrudes प्रभाव के साथ actin filaments के लक्ष्यीकरण बदल. वर्तमान पद्धति के लिए एक सीमा है कि कोशिका मृत्यु के stochastic और अप्रत्याशित प्रकृति के कारण, हमारे डेटासेट बाहर निकालना के बाद के चरणों पर ध्यान केंद्रित करते हैं. Multicellular actin अंगूठी और संकुचन की दीक्षा के गठन का अध्ययन करने के लिए, भविष्य प्रयोगों fluorescently लेबल उपकला कोशिकाओं है कि आनुवंशिक सेल 10 की मौत के लिए लक्षित कर रहे हैं की एक सबसेट में apoptosis प्रेरित करने के लिए तकनीकों को लागू करेगा. हमारे epidermis में छवि actin गतिशीलता विधि के साथ इस रणनीति के संयोजन जल्दी apoptotic सेल बाहर निकालना करने के लिए प्रमुख कदम के अध्ययन की सुविधा चाहिए. साथ में, इन प्रयोगों से प्राप्त जानकारी काफी उपकला कोशिका बाहर निकालना और अपनी चिकित्सा महत्व के बारे में हमारी समझ के लिए जोड़ देगा.
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Disclosures
पशु कल्याण आश्वासन
सभी इस प्रोटोकॉल का उपयोग zebrafish, Danio rerio में प्रदर्शन प्रक्रियाओं, संस्थागत पशु की देखभाल के द्वारा अनुमोदित किया गया है और यूटा विश्वविद्यालय में समिति (IACUC) का उपयोग करें (एनिमल वेलफेयर आश्वासन 10-07017 #).
Acknowledgments
हम वैज्ञानिक चर्चा, सुझाव, और टिप्पणियों के लिए Rosenblatt प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. GFP ट्रांसजेनिक zebrafish हम भी मेरी Halloran जो कृपया प्लाज्मिड एन्कोडिंग आरएफपी UtrCH और डेविड Grunwald जो सी.के. प्रदान प्रदान धन्यवाद देना चाहूंगा. धन्यवाद भी ग्रेचेन राजा और यूटा विश्वविद्यालय में केन्द्रीकृत Zebrafish संसाधन के उत्कृष्ट और zebrafish के रखरखाव और देखभाल के लिए कर्मचारियों को. यह काम NIH-NIGMS NIH निदेशक नई अन्वेषक जे आर के लिए एक पुरस्कार OD002056-01 DP2 द्वारा समर्थित किया गया था. GTE NIH इन दोनों क्षेत्रों कैंसर प्रशिक्षण कार्यक्रम अनुदान CA03247 8-5T32 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
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- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
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