Summary
死細胞は、バリア機能を中断することなく、隣接する細胞の協調した収縮によって上皮組織から押し出される。ゼブラフィッシュの開発の光学的透明度は、上皮の生体内で押し出しを可視化するための優れたシステムを提供します。ここでは、携帯電話の解像度で幼生ゼブラフィッシュの表皮で押し出しを誘発し、イメージする方法を説明します。
Abstract
上皮組織の恒常性維持は、バリア機能を中断することなく、損傷した細胞の継続的な除去が必要です。我々の研究は、死細胞がその終了に起因している可能性のある隙間を閉じながら上皮シートからそれをイジェクトするアクチンとミオシンの環を形成し、収縮する彼らのライブの隣人にシグナルを送ることを発見した、プロセスは、細胞の押し出し1と呼ばれる。ゼブラフィッシュの開発の光学的透明度は、上皮の生体内で押し出しを可視化するための優れたシステムを提供します。ここでは、幼虫のゼブラフィッシュの表皮で押し出しを誘発し、イメージする方法を説明します。押し出しを可視化するために、我々は、表皮の緑色蛍光タンパク質を発現する1細胞期トランスジェニックゼブラフィッシュの胚に、F -アクチンのために赤色蛍光タンパク質標識プローブを注入し、幼虫にG418を添加することによってアポトーシスを誘導する。私たちは、その後アポトーシス細胞の押し出しの過程でアクチンのダイナミクスと上皮細胞の挙動を観察するために回転するディスク共焦点顕微鏡でタイムラプスイメージングを使用してください。このアプローチは、私たちは生きて上皮に押出プロセスを調査することができますし、アポトーシス細胞を除去するために障害に起因する疾患状態を研究する手段を提供します。
Protocol
ゼブラフィッシュの開発の表皮の細胞の押出中にアクチンダイナミクスの可視化のための基本的なワークフロー
開発ゼブラフィッシュの表皮は、2つの別個の層、表面層（または周皮）と基底膜2を連絡し、細胞の基底層で構成されています。外側の表面層の細胞がアポトーシスを起こすと押し出し3（図1）によって組織から排除されています。リアルタイムでこのプロセスを視覚化するために、我々は緑色蛍光タンパク質（GFPを発現している1細胞期トランスジェニックゼブラフィッシュにユートロフィン、アクチン結合タンパク質（RFP - UtrCH）4,5、のカルポニン相同ドメインに融合されたRNAエンコーディング赤色蛍光タンパク質を注入する）層化上皮プロモーターサイトケラチン8 6（図2A）の下で。 RFP - UtrCHが普遍的にRNAを注入した後、動物で表現されていますが、我々は、RFPとGFPの両方が表皮（図2B）に特異的にアクチンのダイナミクスに従うことを表現する表層上皮細胞に焦点を当てる。私たちは、その後アポトーシス細胞の押し出しと画像回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて表皮とアクチンフィラメントを誘導し、4Dのデータセットを取得するためにG418と幼虫を扱う。
事前に実験を開始
- in vitroで mMessage mMachine SP6キット（Ambion社）を用いて線状化DNAテンプレートからRNAの転写とRNeasyミニキット（キアゲン）を用いてキャップRNAを精製する。滅菌水を用いて〜60ng/ulにRNAを希釈し、注入直前まで-80℃で3 -5μlのアリコートと店舗° Cを作る。注意：繰り返しの凍結/ RNAの分解を防ぐために、融解は避けてください。
- 100 × 15ミリメートル培養プレートにE3胚の培地に2％アガロース（E3）の40mlのを注ぐと、このトレイにマイクロインジェクション金型（適応科学のツール、＃I - 34）を配置することにより、注入中に胚を保持するために金型を作る。アガロースが固化した後、アガロースで谷を公開するために金型を削除します。 4使用するため° Cまでの準備でプレートを保管してください。
- フィラメント（OD 1.0ミリメートル、ID 0.78、10cmの長さ）と、以下の設定（耐熱485、プル50、速度60、ディレイ/時間90、圧力200サターP - 97ピペットプラーとホウケイ酸ガラスを使用して注入するためのキャピラリー針を引っ張る）。注：異なる種類のガラスのは、記載されている条件の最適化が必要になります。
- 42℃でE3と店舗1mLのアリコートの1％を構成する低融点（LM）アガロース℃に株式からE3の蒸発は、アガロースの濃度を増加させることができるように注意してください。
- 光/ 14時間の光と闇7の10時間の明暗サイクル定期的に、標準的な実験室条件下で大人のゼブラフィッシュを維持する。実験前の夜は、分周器によって分離槽で3メスと男性2名を配置することによって、相手に魚をセットアップする。翌朝、タンク内の水を変更し、ランプが点灯時に分周器を引き出します。
1。蛍光標識アクチン結合蛋白質をコードするRNAの注入
- 氷の上でRNAを解凍。 〜30ng/μlの最終的なRNA濃度のための1:1の比率でRNAを0.5％フェノールレッドを追加し、埋め戻しによって引っ張らキャピラリー針に1μlのソリューションを読み込みます。
- E3でのGFPの胚：〜75 1セルのステージ8 CKを収集する。ピペットFSTデュモン＃5は鉗子とトラフの胚5でマイクロインジェクションの金型内に胚を採取した¾パスツールピペットと優しく向き。注：注入したRNAのモザイクの発現をもたらすことができる多細胞期の胚、に注入避けるために、迅速に動作するように注意してください。
- 標準的な実験解剖実体顕微鏡下で、圧力制御マイクロインジェクター（ハーバード装置PLI - 100ピコインジェクター）を使用して、胚の卵黄にRNAを注入する。赤いスポット（フェノールレッド）は、注入後の胚に見えるはずです。各実験のために少なくとも50胚を注入する。 （ゼブラフィッシュの胚9にRNAの注入についての詳細なプロトコルのための以前のJoveのプロトコルを参照してください）。注：
- 〜2nlの体積は、1細胞期胚にRNAの注入に使用する必要があります。注入されたRNAの量を決定するために、較正されたマイクロメータのスライド上にミネラルオイルを一滴にまたは接眼レンズに組み込まれたスケールバーと顕微鏡下でRNAのボーラスを分注する。 RNAの液滴は完全な球体にする必要があります。ボリューム（NLで）=4/3πr3：式を使用して配信量を計算します。楽器の射出圧力や時刻を変更して納入音量を調整します。
- ケアはまた、RNAの高濃度は胚発生に有害であることができるとして、蛍光体の可視化を可能にするRNAの最小量を注入するために注意が必要です。適切な発現レベルを決定するために、用量曲線の実験は、実験を実行する前に実行する必要があります。</ LI>
- 任意の未受精卵または破損した卵を削除し、28.5で、残りのすべての胚を配置するために胚をソート℃に
- 24時間後、GFP（表皮）とRFP（アクチン）蛍光の高いレベルを持っているゼブラフィッシュ胚を選択するために蛍光解剖顕微鏡を使用してください。 28.5で選択された胚を置きます° Cアポトーシスを誘導する薬物治療を続行する準備が整うまで。
2。 G418を使用してゼブラフィッシュ幼生におけるセル押出の誘導
我々は、アミノグリコシド系抗生物質G418、またはジェネティシン、への暴露が未知の機構により、ゼブラフィッシュの幼虫3を開発中のアポトーシスと表皮細胞の押し出しを引き起こすことを発見した。重要なのは、この治療法は、わずか4日後の受精と古い幼虫で動作します。我々は、〜5月25日細胞はG418治療幼虫のゼブラフィッシュの上皮フィンから任意の時点で押し出し見つけることができることがわかります。アポトーシス押し出し細胞の量は魚から魚へのさまざまな種類があるため、我々は、イメージングのための複数の魚を取り付けることをお勧めします。
- 収集し、4日後の受精（DPF）E3の3ミリリットル（MLS）を含む、35 × 10mmの培養皿にGFPとRFPの蛍光の両方を示すゼブラフィッシュの幼虫を置く。一つは、このサイズの培養皿で25幼虫まで扱うことができます。
- 慎重に28.5℃で4時間薬でG418とインキュベート幼虫のE3を含む1mg/mLの3mLsでメディアを交換G418は、敏感な光であることに注意してくださいので、カバーや暗所で培養皿を維持するように注意してください。
- メディアを取り出し、0.02％Tricaineを含む予め温めておいた28.5 ° C E3メディアと交換して、幼虫を取り付けに進みます。
3。イメージング用取付ゼブラフィッシュの幼虫
- 1.5mlのエッペンドルフチューブに3幼虫を移し、チューブの底に魚のシンク後のE3の大部分を取り除く。我々は、アガロースが固化する前に、最大3匹までが適切にマウントすることができることを見出した。
- その後、チューブ、ミックス、そして静かにピペットマテックの培養皿の底にカバーガラス上に幼虫とアガロース混合物に、1％LM -アガロース（42 ° C）のピペット120ulをカットしたピペットチップを使用する。
- オリエント迅速に、幼虫を添付インサートピンまたはタングステン針とFSTピンホルダーを使用して、彼らはストレートとマテック皿のカバーガラスに対して平らになるように。
注：私たちは通常、試料への損傷を防ぎながら、彼らがカバーガラスに対して平らになるように、最初の向き幼虫とし、L字型のピンに直接ピンを使用する。 - アガロースが固化した後、静かに0.02パーセントTricaineを含むE3で皿を埋める。注：別の方法として、G418は1mg/mL G418への長期暴露は、幼虫を殺すだろうが、誘導の押し出しを継続するイメージング皿の中でE3に追加することができます。
4。回転するディスク共焦点顕微鏡を用いてセルの押出中にアクチンダイナミクスと個々の上皮細胞の挙動のイメージングを生きる
我々は、ゼブラフィッシュの幼虫を開発するの表皮からアポトーシス細胞の押出のプロセス全体が約20分3を取ることを発見した。ここでは、押出プロセスを可視化するためにゼブラフィッシュ表皮の単層を介してのz平面のシリーズを収集するタイムラプスイメージングの実験をセットアップする方法を示します。我々は典型的な広視野蛍光顕微鏡は、アクチンフィラメントの著しい退色を引き起こすことを発見したとタイムラプスイメージングのために許可されていません。したがって、私たちの分解能を最大化し、退色を防止するため、我々は、回転するディスク共焦点顕微鏡を使用してください。以下に我々は、説明した原理は同じような顕微鏡のセットアップに適用することができますが、ニコンの顕微鏡でアンドールのIQのソフトウェアを使用して実験をセットアップする方法について説明します。
- 最初に、アルゴン（488nmのでGFPの励起用）とヘリウムネオン（561nmにおけるRFPの励起のための）レーザー、顕微鏡、カメラと落射蛍光ランプをオンにします。
- アンドールIQのソフトウェア（バージョン1.10.1）の中で、、画像のキャプチャとキャプチャを繰り返すことが必要数時間の間の間隔の周波数を画像にしたいの波長を含む時系列のプロトコルを作成します。
- ゆっくりと顕微鏡ステージ上に試料を含むマテック皿を置いて、幼虫に焦点を透過光で20倍対物レンズを使用してください。
- 正しい位置に40X水浸対物レンズ（NA 0.8）に移動します。この目標を使用して、我々はまた、サブセルラーアクチンのダイナミクスを解決しているときに私たちは押出中に細胞の挙動を追跡することができるフィールドあたり約20〜25細胞を、フィルムができます。注：同じ取り付けと長い作動距離を持つ40X水浸対物レンズを使用する必要がありますが、イメージング戦略は、直立顕微鏡に適用することができます。
- 慎重に40倍対物レンズの上に水滴を置いて、すぐに上にマテック皿を置きます。ないE：水の蒸発が問題となる場合ツァイスImmersolの浸液を使用することもできます。
- 相またはDIC照明を使用して試料を識別し、GFP陽性表皮に特に焦点を当てる488nmの落射蛍光を使用してください。
- 走査型共焦点モードに切り替えます。それに応じてチャネル（488nmのと561nm）のそれぞれのためのレーザー強度と露光時間を調整します。あなたの信号の最適な検出のために露出のレーザーパワーと時間のバランスをとるために、任意の光退色や毒性を防ぐために注意してください。
- 細胞を押し出す識別するには、表皮というラベルのGFPを視覚化し、中央の小円形細胞を周囲の細胞の集まりで構成される、古典的なロゼットパターンのセルのグループを識別するために、落射蛍光使用。走査型共焦点モードを使用して、また中央の小円形細胞、細胞の押し出しの特徴の周りのリングのような目に見えるRFPで標識したアクチンの蓄積があるはずです。したらすぐに4D（XYZタイム）共焦点のデータセットを取得するために顕微鏡を設定、押し出し細胞を同定した。
- 押し出し細胞を含む表皮の単層を、視覚化、およびステップサイズを選択するにはz平面内で上下のポイントを設定します。タイムラプスイメージングのために、繰り返しのイメージのキャプチャおよび番号の間隔を設定します。例えば、我々は、通常、1μmのステップサイズ、30分毎に1〜2分で、5 -10μmのをスパニングZ -シリーズを取得する。
- データを表示するには、我々は通常、Zシリーズの3次元投影を作成し、クイックタイム（アップル）と互換性のあるムービーファイルとしてデータセットを保存します。このように、我々はアクチンリングと時間をかけて死ぬ細胞の周囲に発生する上皮行動の収縮を視覚化することができます。
5。代表的な結果
図1。アポトーシス細胞の押し出しの回路図。アクチンフィラメントは赤で表示され、GFP陽性上皮細胞は緑色です。
図2。実験的なワークフロー。実験のためのワークフローのA.の回路図。B。 4dpf CKの表皮におけるRFP - UtrCHの発現：GFPゼブラフィッシュ。
図3。スティル上皮細胞の押出成形の過程でライブアクチンダイナミクスを以下のタイムラプスビデオからのフレーム（Z -突起）。矢印は、2分かけて収縮すると閉じます隣接する細胞によって形成されるアクチンのリングを示す。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、ライブ上皮組織で押し出しのプロセスを可視化する単純で簡単な方法を示しています。このタイプの実験は、私たちは以前に固定された組織の分析に感謝しないアクチンダイナミクスの微妙な違いを調べることができる、そしてそれゆえ、一般的な免疫方法を補完する。として我々は、より我々は炎症反応や損傷した細胞の蓄積につながると期待されるアポトーシス細胞を除去し、クリアに失敗に関連付けられている押出プロセスと学習の病気の状態を分析するために化学的阻害剤や遺伝子の変異体と組み合わせて、このプロトコルを使用することができます癌に見られる。例えば、私たちの研究室では、以前に化学物質の阻害剤は細胞が3を押し出す方向の要因となる細胞の基底外側表面に沿ってアクチンフィラメントのターゲットを変更するG418と組み合わせて使用することができることが示されている。現在の方法の1つの制限は、細胞死の確率と予測不可能な性質のため、私たちのデータセットは、押し出しの後の段階に焦点を当てる傾向があるということです。多細胞アクチンリングと収縮の開始の形成を研究するために、将来の実験では遺伝的に細胞死10を対象としている蛍光標識上皮細胞のサブセットにアポトーシスを誘導するテクニックを適用します。表皮内の画像アクチンダイナミクスに対する我々のメソッドでこの戦略を組み合わせることで、アポトーシス細胞の押し出しにつながる初期段階の研究を促進すべきである。一緒に、これらの実験から得られた情報は、上皮細胞の押し出しとその医学的重要性の理解に大きく追加されます。
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Disclosures
動物福祉の保証
ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュを使用して、このプロトコルで実行されるすべての手順は、ユタ大学（動物福祉の保証＃10から07017まで）での動物実験使用委員会（IACUC）によって承認されている。
Acknowledgments
我々は科学的な議論、提案、およびコメントのローゼンブラットの研究室のメンバーに感謝。 GFPトランスジェニックゼブラフィッシュ：我々はまた、親切にCKを提供するをコードするプラスミドRFP - UtrCHとデビッドグルンワルドを提供メアリーハロランに感謝したいと思います。また、グレッチェン王とゼブラフィッシュの優れたメンテナンスとケアのためのユタ大学の集中化ゼブラフィッシュのリソースのスタッフのおかげ。この作品は、JRへOD002056 - 01 DP2 NIH - NIGMS NIHのディレクターの新イノベーター賞1でサポートされていました。 GTEは、NIH集学的がん研修プログラムグラント5T32 CA03247 - 8によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
