Summary
Stervende cellen zijn geëxtrudeerd uit epitheelweefsels door gezamenlijke contractie van naburige cellen zonder verstoring van de barrièrefunctie. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we methoden om te induceren en imago extrusie in het larvale zebravis epidermis op cellulair resolutie.
Abstract
Homeostatische onderhoud van epitheelweefsels vereist de voortdurende verwijderen van beschadigde cellen zonder verstoren barrièrefunctie. Onze studies hebben gevonden dat stervende cellen signalen sturen naar hun live buren om vormen en contract een ring van actine en myosine dat het uitgeworpen uit het epitheliale terwijl het vel sluiten eventuele lacunes die misschien hebben geresulteerd uit zijn afrit, een proces genoemd cel extrusie 1. De optische helderheid van ontwikkelen zebravis biedt een uitstekende systeem om extrusie visualiseren in levende epithelia. Hier beschrijven we één methode om induceren en imago extrusie in de larvale zebravis epidermis. Tot visualiseren extrusie, we injecteren een rode fluorescerend eiwit gelabelde probe voor F-actine in een-cellig stadium transgene zebravis embryo uitdrukken groen fluorescerend proteïne in de epidermis en induceren apoptose door toevoeging van G418 naar larven. Vervolgens gebruiken we time-lapse imaging op een spinning disc confocale microscoop te actine dynamiek en epitheelcellen gedragingen observeren tijdens het proces van apoptotische cel extrusie. Deze aanpak laat ons toe het extrusieproces onderzoeken in live epithelia en zal een laan om ziekte toestanden veroorzaakt door het onvermogen om apoptotische cellen elimineren bestuderen.
Protocol
Basic Workflow voor de visualisatie van Actin Dynamics Tijdens Cel Extrusion in de epidermis van de ontwikkelingslanden zebravis
De epidermis van de zich ontwikkelende zebravis bestaat uit twee verschillende lagen, de oppervlaktelaag (of periderm) en een basale laag van cellen die de basale membraan twee contact. De cellen van de buitenste oppervlaktelaag ondergaan apoptose en worden geëlimineerd uit het weefsel door extrusie 3 (Figuur 1). Om dit te visualiseren proces in real-time, we injecteren RNA dat codeert voor rood fluorescerend eiwit gefuseerd met de calponin homologie domein van utrofine, een actine-bindend eiwit (RFP-UtrCH) 4,5, in een-cellig stadium transgene zebravis uiten van groen fluorescerend eiwit (GFP ) onder de gestratificeerd epitheel promotor cytokeratine 8 6 (figuur 2A). Hoewel de RFP-UtrCH is alomtegenwoordig uitgedrukt in het dier na het RNA-injectie, richten we ons op de oppervlakkige epidermale cellen die zowel de RFP en GFP specifiek te volgen actine dynamiek in de epidermis (Figuur 2B). Vervolgens hebben we behandelen de larven met de G418 aan apoptotische cellen extrusie en het imago van de opperhuid en actine filamenten met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop te induceren en het verwerven van 4D datasets.
Vóór de start van het Experiment
- In vitro transcriptie van het RNA van een gelineariseerde DNA-template met behulp van de mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) en zuiveren de afgetopte RNA met behulp van de RNeasy Mini kit (Qiagen). Verdun het RNA om ~ 60ng/ul met steriel water, vul aan 3-5μl aliquots en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor injectie. Opmerking: Vermijd repetitieve bevriezen / ontdooien tot afbraak van het RNA te voorkomen.
- Maak een mal om de embryo's te houden tijdens de injectie door het gieten van 40ml van 2% agarose in E3 embryo medium (E3) in een 100 x 15mm cultuur plaat en het plaatsen van een micro-injectie mal (Adaptive Science Tools, # I-34) in deze lade. Nadat de agarose is gestold, verwijder de mal aan het dalen bloot in de agarose. Bewaar de plaat staan bij 4 ° C tot klaar voor gebruik.
- Pull capillaire naalden voor injectie met behulp van borosilicaatglas met filamenten (OD 1,0 mm, ID 0,78, 10cm lengte) en een Sutter P-97 Pipetteer Puller op de volgende instellingen (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay / Time 90, Druk 200 ). Let op: verschillende soorten glas optimalisatie van de vermelde omstandigheden vereisen.
- Make-up 1% Low Melt (LM) agarose in E3 en op te slaan 1mL aliquots bij 42 ° C. Wees voorzichtig als de verdamping van de E3 uit de voorraden kan de agarose concentratie te verhogen.
- Onderhouden volwassen zebravissen onder standaard laboratorium condities, met een normale licht / donker cyclus van 14 uur licht en 10 uur donker 7. De nacht voor het experiment opgezet vissen om te paren door het plaatsen van drie vrouwen en twee mannen in een tank, gescheiden door een scheidingswand. De volgende ochtend, wijzigt u het water in de tank en trek de verdeler als de lampjes gaan branden.
1. Injectie van RNA dat codeert voor de fluorescent gelabeld Actin Binding Protein
- Ontdooi de RNA op het ijs. Voeg 0,5% fenol rood aan de RNA in een 1:1 verhouding voor een uiteindelijke concentratie van RNA ~ 30ng/μl en lading 1μl oplossing in een capillair getrokken naald door de back-vulling.
- Verzamel ~ 75 een-cellig stadium 8 CK: GFP embryo's in E3. Pipet de verzamelde embryo's in de micro-injectie mal met een 5 ¾ Pasteur pipet en voorzichtig oriënteren van de embryo's in de trog met FST Dumont # 5 tang. Let op: zorg om snel te werken als om te voorkomen dat injecteren in een multi-cellig stadium embryo, wat kan resulteren in mozaïek expressie van de geïnjecteerde RNA.
- Onder een standaard laboratorium ontleding stereomicroscoop, injecteer de RNA in de dooier van de embryo's met behulp van een druk-gecontroleerde microinjector (Harvard Apparatuur PLI-100 Pico-injector). Een rode vlek (fenol rood) moet zichtbaar zijn in het embryo na de injectie. Injecteer ten minste 50 embryo's voor elk experiment. (Zie de vorige Jove protocol voor een gedetailleerd protocol op RNA injectie in zebravis embryo's 9). Opmerking:
- Een volume van ~ 2NL moet worden gebruikt voor de injectie van RNA in een-cellig stadium embryo's. Voor het bepalen van de hoeveelheid RNA geïnjecteerd, afzien van een bolus van het RNA in een daling van minerale olie op een gekalibreerde micrometer dia of onder een microscoop met een schaal bar ingebouwd in de oculairs. De druppel van RNA zou een perfecte bol is. Bereken de hoeveelheid geleverd door gebruik te maken van de vergelijking: Volume (in nl) = 4/3πr 3. Pas het volume aan geleverd door het veranderen van de inspuitdruk of de tijd op het instrument.
- Zorg moet ook rekening worden gehouden met het laagste bedrag van RNA, dat visualisatie van de fluorofoor laat injecteren, omdat hoge concentraties van RNA kan giftig zijn voor de zich ontwikkelende embryo. Om te bepalen passende uitdrukking niveau moet een dosis-curve experiment worden uitgevoerd voordat u het experiment. </ Li>
- Sorteer de embryo's op een onbevruchte of beschadigde eieren te verwijderen en alle resterende embryo's plaats bij 28,5 ° C.
- Na 24 uur, gebruik maken van een fluorescerende dissectiemicroscoop te zebravis embryo's die een hoge mate van GFP (epidermis) en RFP (actine) fluorescentie hebben te selecteren. Plaats de geselecteerde embryo's bij 28,5 ° C tot klaar om te gaan met de medicamenteuze behandeling om apoptose te induceren.
2. Inductie van Cell Extrusion in zebravis Larven gebruik van G418
We hebben gevonden dat blootstelling aan de aminoglycoside antibiotica G418, of Geneticine, apoptose en extrusie van epidermale cellen bij de ontwikkeling van de zebravis larven 3 door een onbekend mechanisme veroorzaakt. Belangrijk is dat deze behandeling werkt alleen op larven die vier dagen na de bevruchting en ouder. We vinden dat ~ 5-25 cellen kan worden gevonden extruderen op een gegeven moment uit het fin epitheliale van de G418 behandeld larvale zebravis. Naarmate de hoeveelheid apoptotische cellen extruderen kan variëren van vis tot vis, is het raadzaam meerdere vissen voor de beeldvorming.
- Verzamelen en plaats vier dagen na de bevruchting (DPF) zebravis larven vertonen zowel de GFP en RFP fluorescentie in een 35 x 10mm cultuur schotel met 3 milliliter (MLS) van de E3. Men kan maximaal trakteren op 25 larven in dit formaat cultuur gerecht.
- Plaats voorzichtig de media met 3mLs van de E3 met 1mg/ml van de G418 en incubeer larven in het geneesmiddel gedurende 4 uur bij 28,5 ° C. Merk op dat G418 is licht gevoelig, dus zorg om de cultuur schotel bedekt of in het donker.
- Verwijder de media en te vervangen door voorverwarmd 28,5 ° C E3 medium met 0,02% tricaïne en ga verder met het monteren van de larven.
3. Montage zebravis Larven for Imaging
- Transfer 3 larven op een 1,5 ml Eppendorf buis en verwijder het grootste deel van de E3 na de vis zinken naar onderkant van de buis. Wij hebben geconstateerd dat tot drie dieren naar behoren kunnen worden gemonteerd voordat de agarose stolt.
- Het gebruik van een cut pipet tip, pipet 120ul van 1% LM-agarose (42 ° C) in de buis, mix, en dan zachtjes pipet de larven en de agarose mengsel op de dekglaasje op de bodem van een MatTek cultuur schotel.
- Met behulp van een FST pin houder met een insert pin of wolfraam naald er snel oriënteren de larven, zodat ze zijn recht en plat tegen de dekglaasje van het MatTek schotel.
Opmerking: Wij typisch een rechte pin te gebruiken om eerst oriënteren en daarna de larven een L-vormige pin te zorgen dat ze plat tegen de dekglaasje terwijl het voorkomen van schade aan de monsters. - Nadat de agarose gestold is, voorzichtig vul de schotel met de E3 met 0,02% tricaïne. Opmerking: Als alternatief, G418 kan worden toegevoegd aan de E3 in de beeldvorming schotel naar het induceren van extrusie blijven, hoewel de langdurige blootstelling aan 1mg/ml G418 zal de larven doden.
4. Live-Imaging van actine Dynamics en de individuele epitheelcellen gedrag tijdens Cell Extrusie met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop
We hebben gevonden dat het hele proces van apoptotische cellen extrusie van de opperhuid van de ontwikkeling van de zebravis larven ongeveer 20 minuten duurt 3. Hier laten we zien hoe u een time-lapse imaging experiment om een reeks van z vliegtuigen verzamelen via een enkele laag van de zebravis epidermis om de extrusie-proces te visualiseren setup. We hebben ontdekt dat typische groothoek fluorescerende microscopen significant fotobleken van de actine filamenten en houden geen rekening met timelapse beeldvorming veroorzaken. Daarom, om onze resolutie te maximaliseren en te voorkomen fotobleking maken wij gebruik van een draaiende schijf confocale microscoop. Hieronder beschrijven we hoe het opzetten van het experiment met de Andor IQ-software met een Nikon microscoop, hoewel de besproken principes kunnen worden toegepast op soortgelijke microscoop set-ups.
- Zet eerst de Argon (voor excitatie van GFP op 488nm) en HeNe (voor excitatie van RFP op 561nm) lasers, microscoop, camera en epifluorescerende lamp.
- Binnen de Andor IQ-software (versie 1.10.1), een tijdreeks protocol met de golflengtes die u wilt beeld te creëren, de frequentie van de intervallen tussen beeld vangt en het aantal keer vast te leggen moet worden herhaald.
- Plaats voorzichtig de MatTek schotel met uw exemplaar op de microscoop podium en gebruik een 20x objectief met doorvallend licht te richten op de larven.
- Verplaats de 40X water immersie objectief (NA 0,8) in de juiste positie. Met behulp van deze doelstelling kunnen we film ongeveer 20-25 cellen per veld, die ons in staat stelt om cellulaire gedrag te volgen tijdens de extrusie terwijl ook het oplossen van sub-cellulair actine dynamiek. Opmerking: Dezelfde montage-en imaging-strategieën kunnen toegepast om rechtop microscopen zijn, hoewel een 40X water immersie objectief met een lange werkafstand moet worden gebruikt.
- Plaats voorzichtig een druppel water op de bovenkant van de 40x objectief en snel de MatTek schotel plaatsen op de top. Niete: Zeiss Immersol onderdompeling oplossing kan ook worden gebruikt als verdamping van het water is een probleem.
- Identificeer het preparaat met behulp van fase of DIC verlichting en gebruik 488nm epifluorescentie die zich specifiek richt op de GFP positieve epidermis.
- Schakel over naar confocale scanning modus. Stel de laser-intensiteit en de belichtingstijd voor elk van de kanalen (488nm en 561nm) dienovereenkomstig. Zorg ervoor dat het laservermogen en de tijd van de blootstelling balans voor een optimale detectie van uw signaal en eventuele fotobleking of toxiciteit te voorkomen.
- Het identificeren van extruderen cellen gebruiken epifluorescentie te visualiseren van de GFP-gelabelde opperhuid en een groep cellen in een klassieke rozet patroon te kunnen identificeren, bestaande uit een verzameling cellen rondom een kleine ronde cel in het midden. Met behulp van confocale scanning mode, moet er ook een accumulatie van de RFP-label actine zichtbaar als een ring rond de kleine ronde cel in het midden, een kenmerk van de cel extrusie. Als je eenmaal hebt geïdentificeerd extruderen een cel, al snel het opzetten van de microscoop om 4D (XYZ-Time) confocale datasets te verwerven.
- Zet de bovenste en onderste punten in het Z-vlak om een enkele laag van de opperhuid, waaronder het extruderen cel zichtbaar te maken, en de stap te selecteren. Voor time-lapse imaging, de intervallen voor het vastleggen van beelden en het aantal herhalingen. Zo hebben we meestal het verwerven van een z-series verspreid over 5-10μm, met een 1 micrometer stapgrootte, om de 1-2 minuten gedurende 30 minuten.
- Om de gegevens, we maken doorgaans 3-D projecties van de Z-serie en de gegevens opslaan in te stellen als een filmbestand die compatibel is met Quick Time (Apple). Op deze manier kunnen we visualiseren samentrekking van de actine ring en epitheliale gedragingen die zich voordoen rond de stervende cel na verloop van tijd.
5. Representatieve resultaten
Figuur 1. Schematische van apoptotische cellen extrusie. Actine filamenten worden weergegeven in het rood, GFP positieve epidermale cellen zijn groen.
Figuur 2. Experimentele Workflow. A. Schematische weergave van de workflow voor het experiment. B. Expressie van RFP-UtrCH in de epidermis van een 4dpf CK: GFP zebravis.
Figuur 3. Still frames (z-projecties) van een time-lapse film die leven actine dynamiek volgt tijdens het proces van epitheelcellen extrusie. Pijlen geven de ring van actine wordt gevormd door naburige cellen welke contracten en sluit in de loop van 2 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven demonstreert een eenvoudige en doeltreffende methode om het proces van extrusie visualiseren in een live epitheelweefsel. Dit type van experiment laat ons toe om te onderzoeken subtiliteiten van actine dynamiek nog niet eerder op prijs gesteld in vaste weefsel analyses, en daarom een aanvulling op gemeenschappelijke immunofluorescentie methoden. We kunnen dit protocol in combinatie met chemische remmers of genetische mutanten beter te analyseren het extrusieproces en studie ziektebeelden samenhangen met het niet te verwijderen en duidelijk apoptotische cellen, waarvan wij verwachten dat zal leiden tot ontstekingsreacties of de accumulatie van beschadigde cellen, zoals gezien bij kanker. Zo heeft ons laboratorium eerder aangetoond dat de chemische-remmers kunnen worden gebruikt in combinatie met G418 om de gerichtheid van de actine filamenten veranderen langs het basolaterale oppervlak van de cel, die de richting van een cel extrudeert 3 effecten. Een beperking aan de huidige methode is dat te wijten aan de stochastische en onvoorspelbare karakter van celdood, ons datasets richten zich vooral op de latere stadia van extrusie. Het bestuderen van de vorming van de meercellige actine ring en de start van krimp, zullen toekomstige experimenten toe te passen technieken om apoptose te induceren in een subset van fluorescent gelabelde epitheliale cellen die genetisch zijn gericht op celdood 10. De combinatie van deze strategie met onze methode om de afbeelding actine dynamiek in de epidermis moet vergemakkelijken studies van de vroege stappen die leiden tot apoptotische cel extrusie. Samen zullen de informatie op basis van deze experimenten aanzienlijk toe te voegen aan ons begrip van epitheelcellen extrusie en de medische betekenis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dierenwelzijn Assurance
Alle procedures uitgevoerd in dit protocol het gebruik van de zebravis, Danio rerio, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Utah (Animal Welfare Assurance # 10-07017).
Acknowledgments
Wij danken de leden van de Rosenblatt laboratorium voor wetenschappelijke discussies, suggesties en opmerkingen. We willen ook graag aan Maria Halloran die vriendelijk op voorwaarde dat de plasmide coderend voor RFP-UtrCH en David Grunwald, die op voorwaarde dat de CK bedanken: GFP transgene zebravis. Dank ook aan Gretchen Koning en het personeel van de Centrale zebravis Resource aan de Universiteit van Utah voor een uitstekende onderhoud en de verzorging van de zebravis. Dit werk werd ondersteund door New Innovator Award NIH-NIGMS NIH directeur een DP2 OD002056-01 naar JR. GTE werd ondersteund door NIH Multidisciplinaire Cancer Training Program Grant 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
