Summary
Cellule morenti vengono estrusi da tessuti epiteliali dalla contrazione concertata delle cellule vicine senza interrompere la funzione di barriera. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrivono i metodi per indurre ed estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale a risoluzione cellulare.
Abstract
Mantenimento dell'omeostasi dei tessuti epiteliali richiede la rimozione continua di cellule danneggiate senza interrompere la funzione di barriera. I nostri studi hanno trovato che le cellule morenti inviare segnali ai loro vicini di formare e vivere contratto un anello di actina e miosina che lo espelle fuori dal foglio epiteliali durante la chiusura eventuali lacune che potrebbero avere provocato dalla sua uscita, un processo chiamato estrusione in cella 1. L'ottica degli zebrafish di sviluppo, prevede un ottimo sistema per visualizzare estrusione nel vivere epiteli. Qui si descrive un metodo per indurre e estrusione immagine nell'epidermide zebrafish larvale. Per visualizzare estrusione, abbiamo iniettare una sonda rossa proteina fluorescente etichettato per la F-actina in una cella di embrioni di zebrafish fase transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde a livello epidermico e indurre apoptosi mediante l'aggiunta di G418 di larve. Utilizziamo quindi time-lapse imaging su un microscopio confocale a disco rotante per osservare dinamiche di actina e dei comportamenti delle cellule epiteliali durante il processo di estrusione cellulare per apoptosi. Questo approccio ci permette di indagare il processo di estrusione a vivere epiteli e fornirà una via per studiare stati di malattia causata dalla mancata eliminazione di cellule apoptotiche.
Protocol
Flusso di lavoro di base per la visualizzazione di Dinamica actina durante l'estrusione cella nel Epidermide di Zebrafish in via di sviluppo
L'epidermide del pesce zebra di sviluppo è composto da due strati distinti, lo strato superficiale (o periderm) e uno strato basale di cellule che contattare la membrana basale 2. Le cellule dello strato superficiale esterno apoptosi e vengono eliminati dal tessuto di estrusione 3 (Figura 1). Per visualizzare questo processo in tempo reale, abbiamo iniettare RNA codifica una proteina fluorescente rossa fusa al dominio di omologia calponina utrophin, una proteina actina vincolante (RFP-UtrCH) 4,5, in una cella di zebrafish fase transgenici che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP ) sotto il promotore citocheratina epiteli stratificati 8 6 (Figura 2A). Anche se RFP-UtrCH è ubiquitariamente espressa l'animale dopo l'iniezione di RNA, ci concentriamo sulle cellule superficiali dell'epidermide che esprimono entrambe le RFP e GFP per seguire le dinamiche actina specificamente nell'epidermide (Figura 2B). Abbiamo poi trattare le larve con G418 di indurre apoptosi delle cellule di estrusione e l'immagine dei filamenti di actina epidermide e usando un microscopio confocale a disco rotante e di acquisire serie di dati 4D.
Prima di iniziare l'esperimento
- In vitro trascrivere l'RNA da un modello di DNA linearizzato utilizzando il mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) e purificare l'RNA innevate utilizzando il RNeasy Mini kit (Qiagen). Diluire l'RNA a ~ 60ng/ul con acqua sterile, fare 3-5μl aliquote e conservare a -80 ° C fino al momento dell'iniezione. Nota: Evitare di congelare e ripetitivo / scongelamento per evitare la degradazione dell'RNA.
- Fare uno stampo per tenere gli embrioni durante l'iniezione versando 40 ml di agarosio al 2% nel medio embrione E3 (E3) in un 15 millimetri x 100 piastra di coltura e l'immissione di uno stampo microiniezione (Adaptive Strumenti Scienza, # I-34) in questo vassoio. Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere lo stampo per esporre le depressioni in agarosio. Conservare la piastra a 4 ° C fino al momento dell'utilizzo.
- Tirare aghi capillare per iniezione utilizzando vetro borosilicato con filamenti (OD 1.0mm, ID 0,78, lunghezza 10 cm) e un P-97 Estrattore Pipettare Sutter a le seguenti impostazioni (Calore 485, Pull 50, velocità 60, Delay / ora 90, pressione 200 ). Nota: I diversi tipi di vetro richiede l'ottimizzazione delle condizioni elencate.
- Costituiscono l'1% Low Melt (LM) agarosio in E3 e conservare 1mL aliquote a 42 ° C. Fare attenzione a come l'evaporazione di E3 dalle scorte può aumentare la concentrazione di agarosio.
- Mantenere zebrafish adulti in condizioni di laboratorio standard, con un regolare luce / buio ciclo di 14 ore di luce e 10 ore di buio 7. La notte prima l'esperimento costituito di pesce di accoppiarsi mettendo 3 femmine e 2 maschi in una vasca separati da un divisorio. La mattina seguente, cambiare l'acqua nel serbatoio e tirare il divisore quando le luci si accendono.
1. L'iniezione di RNA codifica per la proteina fluorescente Actina Tagged Binding
- Scongelare il RNA sul ghiaccio. Aggiungere 0,5% rosso fenolo per l'RNA con un rapporto 1:1 per una concentrazione finale di RNA di ~ 30ng/μl e caricare 1ml soluzione in un ago capillare tirato da back-filling.
- Raccogliere ~ 75 1-cellula fase 8 CK: embrioni GFP in E3. Preparare la pipetta raccolti embrioni nello stampo microiniezione con un 5 ¾ Pasteur e delicatamente orientare gli embrioni nella vasca con FST Dumont # 5 pinze. Nota: fare attenzione a lavorare in fretta per evitare di iniettare in un multi-cellula embrionale fase, che può portare a mosaico espressione dell'RNA iniettato.
- Sotto uno stereomicroscopio standard di laboratorio dissezione, iniettare l'RNA nel tuorlo degli embrioni usando una pressione controllata microinjector (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-iniettore). Una macchia rossa (rosso fenolo) dovrebbe essere visibile nell'embrione dopo l'iniezione. Iniettare almeno 50 embrioni per ciascun esperimento. (Vedere il precedente protocollo Giove per un protocollo dettagliato sulla iniezione di RNA in embrioni di zebrafish 9). Nota:
- Un volume di circa 2NL dovrebbe essere usato per l'iniezione di RNA in una cella-embrioni palco. Per determinare la quantità di RNA iniettato, dispensare un bolo di RNA in una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico calibrato o sotto un microscopio con una barra di scala costruita negli oculari. La goccia di RNA dovrebbe essere una sfera perfetta. Calcolare la quantità consegnata con la seguente equazione: Volume (in nl) = 4/3πr 3. Regolare il volume erogato, modificando la pressione di iniezione o il tempo sullo strumento.
- Si deve inoltre fare attenzione a iniettare l'importo più basso di RNA che consente di visualizzare il fluoroforo, come alte concentrazioni di RNA possono essere tossici per l'embrione di sviluppo. Per determinare il livello appropriato di espressione, una curva dose-esperimento dovrebbe essere effettuato prima di eseguire l'esperimento. </ Li>
- Ordina gli embrioni per rimuovere tutte le uova non fecondate o danneggiati e luogo tutti gli embrioni rimasti a 28.5 ° C.
- Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio a fluorescenza dissezione per selezionare embrioni di zebrafish che hanno un alto livello di GFP (epidermide) e RFP (actina) fluorescenza. Mettere gli embrioni selezionati a 28,5 ° C fino al momento di procedere con il trattamento farmacologico per indurre l'apoptosi.
2. Induzione di estrusione in cella Le larve Zebrafish utilizzando G418
Abbiamo scoperto che l'esposizione al aminoglicoside antibiotico G418, o Geneticin, provoca apoptosi ed estrusione di cellule epidermiche nello sviluppo di larve di zebrafish 3 con un meccanismo sconosciuto. È importante sottolineare che questo trattamento funziona solo sulle larve che sono 4 giorni dopo la fecondazione e più anziani. Troviamo che ~ 5-25 cellule possono essere trovati estrusione in ogni momento dalla pinna epiteliali del pesce zebra G418 trattati larvale. Poiché la quantità di cellule apoptotiche estrusione può variare da pesce a pesce, è consigliato il montaggio più pesce per l'imaging.
- Raccogliere e posto 4 giorno dopo la fecondazione (DPF) larve di zebrafish espositrici sia GFP e RFP fluorescenza in un piatto da 35 x 10 mm cultura contenente 3 millilitri (ml) di E3. Si può trattare fino a 25 larve di questo piatto cultura dimensioni.
- Ricollocare accuratamente i media con 3mLs dell'E3 1mg/mL contenenti delle larve G418 e incubare la droga per 4 ore a 28,5 ° C. Si noti che G418 è sensibile alla luce, in modo da fare attenzione a mantenere il piatto cultura coperto o al buio.
- Rimuovere i supporti e sostituire con pre-riscaldato 28,5 ° C i media E3 contenente 0,02% Tricaine e procedere al montaggio delle larve.
3. Zebrafish Larve di montaggio per l'imaging
- Trasferimento 3 larve in una provetta eppendorf da 1,5 ml e rimuovere la maggior parte delle E3 dopo il lavandino pesce a fondo della provetta. Abbiamo scoperto che fino a 3 animali possono essere correttamente montato prima l'agarosio si solidifica.
- Utilizzando una punta tagliata pipetta, 120ul pipetta di 1% LM-agarosio (42 ° C) nel tubo, mescolare, e poi delicatamente pipetta le larve e la miscela di agarosio sul coprioggetti sul fondo di un piatto cultura MatTek.
- Utilizzando un supporto FST pin con un perno di inserimento o di tungsteno ago inserito, in modo rapido orientare le larve in modo che siano dritte e piatte contro il coprioggetti del piatto MatTek.
Nota: Si utilizzano in genere un perno dritto al primo orientare le larve e poi una a forma di L pin per assicurare che siano piatti contro il coprioggetti evitando danni ai campioni. - Una volta che l'agarosio si è solidificato, gentilmente riempire il piatto con E3 contenente 0,02% Tricaine. Nota: in alternativa, G418 può essere aggiunto alla E3 nel piatto di imaging per continuare estrusione indurre, anche se a lungo termine dell'esposizione a 1mg/mL G418 ucciderà le larve.
4. Vivere Imaging di Dynamics actina e comportamenti individuali delle cellule epiteliali durante l'estrusione cella utilizzando un microscopio confocale Disco Spinning
Abbiamo scoperto che l'intero processo di estrusione cellulare per apoptosi dall'epidermide di sviluppo di larve di pesce zebra dura circa 20 minuti 3. Qui mostriamo come impostare un time-lapse esperimento di imaging per raccogliere una serie di piani z attraverso un singolo strato dell'epidermide zebrafish di visualizzare il processo di estrusione. Abbiamo scoperto che widefield tipici microscopi a fluorescenza causa photobleaching significativa dei filamenti di actina e non consentono per l'imaging Timelapse. Pertanto, per ottimizzare la nostra risoluzione e prevenire photobleaching, usiamo un microscopio confocale a disco rotante. Di seguito viene descritto come impostare l'esperimento utilizzando il software IQ Andor con un microscopio Nikon, anche se i principi discussi possono essere applicati a microscopio simili set-up.
- In primo luogo, accendere la Argon (per l'eccitazione del BPA a 488 nm) e HeNe (per l'eccitazione del RFP a 561nm) laser, microscopio, macchina fotografica e lampada epifluorescente.
- All'interno della IQ Andor software (versione 1.10.1), creare un protocollo di serie temporali contenente le lunghezze d'onda si vuole l'immagine, la frequenza degli intervalli tra cattura immagine e il numero di volte la cattura deve essere ripetuto.
- Posizionare delicatamente il piatto MatTek contenente il campione sul palco microscopio e utilizzare un obiettivo 20x con luce trasmessa di concentrarsi sulle larve.
- Spostare il 40X obiettivo immersione in acqua (NA 0,8) nella posizione corretta. Usando questo obiettivo, possiamo pellicola circa 20-25 cellule per campo, che ci permette di seguire comportamenti cellulari durante l'estrusione, mentre anche la risoluzione sub-cellulari dinamiche di actina. Nota: Il montaggio stesso e le strategie di imaging può essere applicata a microscopi diritti, anche se un obiettivo 40X immersione in acqua con una distanza di lavoro deve essere utilizzato.
- Con attenzione una goccia d'acqua sulla parte superiore dell'obiettivo 40x e rapidamente posto il piatto MatTek in cima. None: Zeiss soluzione immersione Immersol può essere utilizzato anche se l'evaporazione dell'acqua è un problema.
- Identificare il campione usando fase o illuminazione DIC e quindi utilizzare epifluorescenza 488 nm di concentrarsi specificamente sulle epidermide GFP positive.
- Passare alla modalità di scansione confocale. Regolare l'intensità del laser e tempo di esposizione per ciascuno dei canali (488nm e 561nm) di conseguenza. Fare attenzione a bilanciare la potenza del laser e il tempo di esposizione per il rilevamento ottimale del segnale e per prevenire qualsiasi photobleaching o tossicità.
- Per identificare le cellule estrusione, utilizzare epifluorescenza per visualizzare la GFP etichettato epidermide e di identificare un gruppo di cellule in un modello classico rosetta, costituita da un insieme di cellule che circonda una piccola cella rotonda al centro. Utilizzando la modalità di scansione confocale, ci dovrebbe essere anche un accumulo di actina RFP marcato visibili come un anello intorno alla piccola cella rotonda in mezzo, un segno distintivo di estrusione in cella. Dopo aver identificato una cellula estrusione, impostare rapidamente il microscopio per acquisire 4D (XYZ-Time) set di dati confocale.
- Impostare i punti superiore e inferiore all'interno del piano z per visualizzare un singolo strato dell'epidermide, tra cui la cellula estrusione, e selezionare il passo. Per time-lapse imaging, impostare gli intervalli per l'acquisizione delle immagini e numero di ripetizioni. Per esempio, noi di solito acquisire una serie z-spanning 5-10μm, con una dimensione di 1 micron passo, ogni 1-2 minuti per 30 minuti.
- Per visualizzare i dati, di solito fanno le proiezioni in 3-D della serie z e salvare il set di dati come file di filmato che è compatibile con Quick Time (Apple). In questo modo, possiamo visualizzare la contrazione del ring actina e comportamenti epiteliali che si verificano intorno alla cellula di morire nel corso del tempo.
5. Rappresentante Risultati
Figura 1. Schematica di estrusione cellulare per apoptosi. Filamenti di actina sono mostrati in rosso, le cellule GFP positive epidermiche sono verdi.
Figura 2. Flusso di lavoro sperimentale. A. Schema del flusso di lavoro per l'esperimento. B. Espressione di RFP-UtrCH nell'epidermide di un CK 4dpf: GFP zebrafish.
Figura 3. Immagini fisse (z-proiezioni) da un time-lapse movie che segue dal vivo le dinamiche dell'actina durante il processo di estrusione delle cellule epiteliali. Le frecce indicano l'anello di actina formate da cellule vicine che si contrae e si chiude nel corso di 2 minuti.
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Discussion
Il protocollo qui descritto viene illustrato un metodo semplice e diretto per visualizzare il processo di estrusione in un tessuto vivo epiteliale. Questo tipo di esperimento ci permette di esaminare sottigliezze delle dinamiche di actina in precedenza non apprezzati nelle analisi del tessuto fisso, e quindi, integra comuni metodi di immunofluorescenza. Possiamo usare questo protocollo in associazione con inibitori chimici o mutanti genetici per analizzare meglio il processo di estrusione e stati patologici studio associato alla mancata rimozione e chiaro cellule apoptotiche, che ci aspettiamo porti a risposte infiammatorie o l'accumulo di cellule danneggiate, come visto nel cancro. Per esempio, il nostro laboratorio ha già dimostrato che gli inibitori chimici possono essere usati in combinazione con G418 di modificare l'orientamento dei filamenti di actina lungo la superficie basolaterale della cellula, quali effetti la direzione di una cella estrusioni 3. Una limitazione al metodo attuale è che a causa della natura stocastica e imprevedibile di morte cellulare, il nostro set di dati tendono a concentrarsi sulle fasi successive di estrusione. Per studiare la formazione dell'anello actina pluricellulari e l'inizio della contrazione, esperimenti futuri si applicheranno le tecniche per indurre l'apoptosi in un sottogruppo di fluorescenza marcata cellule epiteliali che sono geneticamente mirati per la morte della cellula 10. Combinando questa strategia con il nostro metodo per l'immagine dinamica actina nell'epidermide dovrebbe facilitare gli studi dei primi passi importanti per estrusione cellulare per apoptosi. Insieme, le informazioni ottenute da questi esperimenti si aggiunge in modo significativo alla nostra comprensione di estrusione delle cellule epiteliali e il suo significato medico.
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Disclosures
Benessere degli animali Assurance
Tutte le procedure eseguite in questo protocollo con il pesce zebra, Danio rerio, sono stati approvati dalla cura degli animali e utilizzo Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Università di Utah (Assurance benessere degli animali # 10-07017).
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del laboratorio Rosenblatt per discussioni scientifiche, suggerimenti e commenti. Vorremmo anche ringraziare Maria Halloran che ha gentilmente fornito la codifica plasmide RFP-UtrCH e David Grunwald che ha fornito il CK: GFP zebrafish transgenico. Grazie anche a Gretchen re e il personale della risorsa Zebrafish centralizzata presso l'Università dello Utah per la manutenzione eccellente e la cura del pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto da Innovator Award di New NIH-NIGMS direttore del NIH di 1 DP2 OD002056-01 a JR. GTE è stato sostenuto dalla formazione multidisciplinare del cancro del NIH Grant Program 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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