Summary
죽어가는 세포는 장벽의 기능을 중단하지 않고 인접 세포의 수축에 의해 공동 상피 조직에서 압출하고 있습니다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기 우리는 세포 해상도에서 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다.
Abstract
상피 조직의 생체 항상성 유지 보수 장벽 기능을 중단하지 않고 손상된 세포의 지속적인 제거가 필요합니다. 우리의 연구는 죽는 세포는 출구에서 결과있을 수있는 격차를 닫는 동안 상피 시트에서 밖으로 배출 굴지과 마이 오신의 고리를 형성하고 계약에 그들의 사는 이웃에게 신호를 보내는 것을 발견, 과정은 세포 압출 1 칭했다. 개발 zebrafish의 광학 선명도는 상피 조직을 생활에 압출을 시각화하는 뛰어난 시스템을 제공합니다. 여기서 우리는 애벌레 zebrafish의 표피의 유도 및 이미지 압출하는 방법을 설명합니다. 압출을 시각화하기 위해, 우리는 표피의 녹색 형광 단백질을 표현 한 세포 단계의 배아 유전자 변형 zebrafish에 F - 굴지의 적색 형광 단백질로 분류 프로브를 삽입하고 애벌레로 G418를 추가하여 apoptosis를 유도. 우리는 다음 apoptotic 세포 압출의 과정에서 굴지의 역학과 상피 세포의 행동을 관찰하기 위해 회전하는 디스크 공촛점 현미경에서 시간 저속 이미지를 사용합니다. 이러한 접근 방식은 우리가 살고 상피 조직에서 압출 프로세스를 조사 수 있으며 apoptotic 세포를 제거하기 위해 실패로 인한 질병 상태를 연구하는 수단을 제공합니다.
Protocol
개발 Zebrafish의 표피에서 셀 압출 동안 굴지 역학 시각화의 기본 워크플로우
개발 zebrafish의 표피는 별개의 두 레이어, 표면 레이어 (또는 periderm)과 지하 막 2 연락 세포의 기저 계층으로 구성되어 있습니다. 외부 표면 층의 세포가 apoptosis를 받아야하고 압출 3 (그림 1)에 의해 조직에서 제거됩니다. 실시간으로이 과정을 시각화하기 위해, 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP를 표현 한 세포 단계 형질 전환 zebrafish에 utrophin, 굴지 바인딩 단백질 (RFP - UtrCH) 4,5의 calponin의 상동 도메인에 융합 RNA 인코딩 적색 형광 단백질을 주입 ) 층상 상피 조직 모터 cytokeratin 8 6 (그림 2A)에서. RFP - UtrCH이 ubiquitously RNA 주입 후 동물의 표현이지만, 우리는 RFP 및 GFP 모두 표피 (그림 2B)에 구체적으로 굴지 역학을 따르도록 표현 외면 표피 세포에 중점을두고 있습니다. 우리는 다음 apoptotic 세포 압출 및 이미지 회전하는 디스크 공촛점 현미경을 사용하여 표피와 굴지 필라멘트를 유도하고 4D의 데이터 세트를 얻기 G418과 애벌레를 처리합니다.
이전 실험을 시작
- 에 체외은 mMessage mMachine SP6 키트 (앰비온)을 사용하여 선형의 DNA 템플릿에서 RNA를 녹음하고 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 뒤덮힌 RNA 정화. 멸균 물을 사용 ~ 60ng/ul로 RNA를 희석, 주입 준비까지 -80 3 - 5μl aliquots하고 저장 ° C합니다. 참고 사항 : 반복적인 동결 / RNA의 저하를 방지하기 위해 해동하지 마십시오.
- 100 X 15mm 문화 판에 E3 배아 매체 (E3)에 2% 아가로 오스의 40mL를 따르고이 트레이에 microinjection 금형 (적응성 과학 도구, # I - 34) 배치하여 주사하는 동안 배아를 잡아 금형을 확인합니다. 아가로 오스가 확정되면, 아가로 오스의 골짜기를 노출하는 곰팡이를 제거합니다. 4 사용 ° C까지 준비에서 접시를 저장합니다.
- 필라멘트 (OD 1.0mm, ID 0.78, 10cm 길이)와 다음과 같은 설정 (히트 485, 당겨 50, 속도 60, 딜레이 / 시간 90 기압 200 서터 P - 97 피펫 풀러와 borosilicate 유리를 사용하여 사출을위한 모세관 바늘을 당겨 ). 참고 : 유리의 종류가 나열된 조건의 최적화가 필요합니다.
- 1퍼센트 42 E3하고 저장 1mL aliquots에서 낮은 용융 (LM) 아가로 오스 ° C.를 확인 주식에서 E3의 증발은 아가로 오스의 농도를 증가시킬 수로주의하십시오.
- 빛 / 14 시간 빛과 어둠 7의 10 시간의 어두운주기 정기와 표준 실험실 조건 하에서 성인 zebrafish를 유지합니다. 전날 밤 실험 구분선으로 구분 탱크 3 여성 2 남성을 배치하여 짝짓기 물고기를 설정합니다. 다음날 아침, 탱크에 물을을 변경하고 불이 어서 때 분할기를 가져옵니다.
1. 찬란 태그 굴지 바인딩 단백질을 인코딩 RNA의 분사
- 얼음에 RNA를 해동. ~ 30ng/μl의 최종 RNA 농도에 대해 1:1 비율에서 RNA로 0.5 % 페놀 레드를 추가하고 백업 작성하여 뽑아 모세관 바늘에 1μl 솔루션을로드합니다.
- 모아서 ~ 75 1 셀 8 단계 CK : E3에서 GFP의 배아. Pipet FST 더몬트 # 5 포셉와 여물 배아 5 microinjection 곰팡이로 배아를 수집 어 파스퇴르 pipet 부드럽게 동양. 참고 : 주입된 RNA의 모자이크 표현을 초래할 수있는 여러 세포 단계의 배아로 주입 피하기 위해 빨리 일을 처리해.
- 표준 실험실 해부 stereomicroscope에서 압력 제어 microinjector (하버드 장치 PLI - 100 피코 - 주입기)를 사용하여 태아의 노른자로 RNA를 주입. 붉은 반점 (페놀 레드) 주사 후 배아에 표시되어야합니다. 각 실험에 대한 최소한 50 배아를 주사. (zebrafish 배아 9로 RNA 주입에 대한 자세한 프로토콜에 대한 이전 조브 프로토콜을 참조). 참고 :
- ~ 2nl의 볼륨은 한 세포 단계의 배아로 RNA의 주입을 위해 사용해야합니다. 주입된 RNA의 양을 확인하려면, 보정 마이크로 미터 슬라이드에 광유의 드롭으로 또는 eyepieces에 내장된 스케일 바와 함께 현미경 RNA의 볼러스 하는걸. RNA의 비말은 완벽한 구형해야합니다. 볼륨 (NL)를 = 4/3πr 3 : 방정식을 사용하여 전달되는 금액을 계산합니다. 악기에 대한 사출 압력 또는 시간을 변경하여 전달 볼륨을 조정합니다.
- 관리는 또한 RNA의 높은 농도가 개발 배아에 독성 수 있으므로, 형광단의 시각화 수 있습니다 RNA의 가장 낮은 금액을 주입로 이동해야합니다. 적절한 표현 수준을 확인하려면, 복용 - 곡선 실험은 실험을 실행하기 전에 수행해야합니다. </ 리>
- 모든 unfertilized 또는 손상된 달걀을 제거하고 28.5에 남아있는 모든 배아 곳으로 배아를 정렬 ° C.
- 24 시간 후에, GFP (표피)와 RFP (굴지) 형광의 높은 수준의 보안을 zebrafish 배아를 선택하는 형광 해부 현미경을 사용합니다. 28.5에서 선택된 배아를 놓고 ° C apoptosis를 유도하기 위해 약물 치료를 계속 준비까지.
2. G418을 사용 Zebrafish 유충의 세포 압출의 유도
우리는 aminoglycoside 항생제 G418, 또는 Geneticin에게 노출이 알려지지 않은 메커니즘에 의해 zebrafish의 유충 3 개발 apoptosis와 표피 세포의 압출를 일으키는 것으로 확인되었습니다. 중요한 것은,이 치료는 사일 게시물 수정과 나이 애벌레에서 작동합니다. 우리는 ~ 5-25 세포 G418 취급 애벌레 zebrafish의 상피 지느러미에서 언제든지 확인하실 수 있습니다 압출 것을 알게됩니다. apoptotic 압출 세포의 금액은 생선에서 고기에 따라 다를 수 있듯이, 우리는 이미지에 대한 여러 물고기를 장착하는 것이 좋습니다.
- 수집 4 일 게시물 수정 (DPF) E3 3 밀리리터 (MLS)를 포함 35 X 10mm 문화 요리에 GFP 및 RFP 형광을 모두 전시 zebrafish의 애벌레를 놓습니다. 하나는이 크기 문화 요리 25 애벌레까지 처리하실 수 있습니다.
- 조심스럽게 28.5 ° C. 4 시간 동안 약물의 G418과 부화 유충의 E3가 포함된 1mg/mL의 3mLs으로 미디어를 대체 G418은 민감한 빛됩니다, 그래서 문화 요리가 대상이나 어둠 속에서 유지하는데주의를 기울여야.
- 미디어를 제거하고 0.02 % Tricaine를 포함하는 미리 예열 28.5 ° C E3 미디어로 교체하고 애벌레를 장착을 참조하십시오.
3. 이미징 장착 Zebrafish의 애벌레
- 1.5 ML eppendorf 튜브 3 애벌레를 전송하고 튜브의 바닥에 물고기 싱크 후 E3의 대부분을 제거합니다. 우리는 아가로 오스가 굳은하기 전에 최대 3 동물이 제대로 장착할 수 것으로 나타났습니다.
- MatTek 문화 요리의 하단에있는 coverglass에 상처 pipet 팁, 튜브에 1퍼센트 LM - 아가로 오스 (42 ° C)의 pipet의 120ul, 믹스, 그리고 부드럽게 pipet 애벌레와 아가로 오스의 혼합물을 사용합니다.
- 그들이 MatTek 요리의 coverglass에 대한 직선과 평면하므로 바늘 방향 신속하게 애벌레를 첨부 삽입 핀 또는 텅스텐과 FST 핀 홀더를 사용하여.
참고 : 우리는 일반적으로 표본의 손상을 방지하는 동안 그들은 coverglass에 대한 평면되도록 먼저 방향 애벌레 그리고 L - 모양의 핀 스트레이트 핀을 사용합니다. - 일단 아가로 오스는 경화되었습니다, 부드럽게 E3가 Tricaine 0.02 %를 포함하는으로 요리를 입력합니다. 참고 : 1mg/mL G418에 장기간 노출이 유충을 죽일 수 있지만 다른 방법으로, G418은, 유도 압출을 계속 이미징 접시에 E3에 추가할 수 있습니다.
4. 스피닝 디스크 공촛점 현미경을 사용하여 셀 압출 동안 굴지 역학과 개인 상피 세포의 동작 영상 라이브
우리는 zebrafish의 유충을 개발의 표피에서 apoptotic 세포 압출의 전체 과정은 약 20 분 소요 3 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 압출 프로세스를 시각화하기 위해 zebrafish 표피의 단일 계층을 통해 Z 비행기 일련의를 수집하는 시간 저속 이미징 실험을 설정하는 방법을 보여줍니다. 우리는 전형적인 형광 현미경 위드 필드가 큰 굴지의 필라멘트의 photobleaching 및 timelapse 이미징에 대한 허용하지 않는 원인 것으로 나타났습니다. 따라서, 우리의 해상도를 극대화하고 photobleaching을 방지하기 위해, 우리는 회전하는 디스크 공촛점 현미경을 사용합니다. 아래 우리는 논의의 원칙은 유사한 현미경 세트 업에 적용할 수 있지만, 니콘 현미경으로 Andor의 IQ 소프트웨어를 사용하여 실험을 설정하는 방법에 대해 설명합니다.
- 먼저, 아르곤 (488nm에서 GFP의 여기를위한)와 HeNe (561nm에서 RFP의 여기에 대한) 레이저, 현미경, 카메라, epifluorescent 램프를 켭니다.
- Andor IQ 소프트웨어 (버전 1.10.1) 내에서, 이미지에 원하는 파장을 포함하는 시계열 프로토콜을 만들, 이미지 캡처와 숫자 사이의 시간 간격의 주파수는 캡처가 반복해야합니다.
- 부드럽게 현미경 무대에서 표본을 포함하고있는 MatTek 요리를 배치하고 애벌레에 초점을 전달 빛이 20x 목적을 사용합니다.
- 올바른 위치에 40X 물 침지 목표 (NA 0.8)를 이동합니다. 이 목표를 사용하여, 우리는 하위 셀룰러 굴지의 역학을 해결하는 동안 우리는 압출 동안 세포 동작을 수행하실 수 있습니다 입력란 당 약 20-25 세포 필름 수 있습니다. 참고 : 동일한 장착과 긴 작동 거리와 40X 물 침지 목표를 사용해야하지만, 이미지 전략은, 직립 현미경 적용할 수 있습니다.
- 조심스럽게 40x 목적의 상단에 물 한 방울을 배치하고 신속하게 위에 MatTek 요리를 놓습니다. 아니E : 물의 증발에 문제가있는 경우 자이스 혈구 Immersol의 집중 솔루션도 사용할 수 있습니다.
- 상 또는 DIC 조명을 사용하여 표본을 확인하고 다음 GFP 긍정적인 표피에 특별히 초점을 488nm epifluorescence를 사용합니다.
- 공촛점 스캔 모드로 전환합니다. 레이저 강도 이에 따라 채널의 각 노출 시간 (488nm 및 561nm) 조정합니다. 신호의 최적 검출을위한 노출의 레이저 파워와 시간을 균형을하고 photobleaching이나 독성을 방지하기 위해 몸조심.
- 압출 세포를 식별하려면, GFP가 표시된 표피를 시각화하고 중간에 작은 원형 세포를 둘러싼 세포의 집합으로 구성된, 고전 로제트 패턴에 세포의 그룹을 식별하는 epifluorescence 사용합니다. 공촛점 스캔 모드를 사용하면, 또한 중간에있는 작은 원형 세포, 세포 압출의 특징 주위에 반지로 보이는 RFP - 라벨 굴지의 축적이 있어야합니다. 일단 빠르게 4D (XYZ 타임) 공촛점 데이터 세트를 얻기위한 현미경을 설정, 압출 세포가 확인되었습니다.
- 압출 세포를 포함하여 표피의 단일 계층을 시각화하고, 단계 크기를 선택하는 Z 평면 내에서 상위 및 하위 점수를 설정합니다. 시간 경과에 대한 이미지는, 반복의 이미지 캡처 및 번호 간격을 설정합니다. 예를 들어, 우리는 일반적으로 1 μm의 단계 크기, 30 분마다 1~2분와 5 10μm를 스팬 Z 시리즈를 취득.
- 데이터를보기 위해, 우리는 일반적으로 Z 시리즈의 3 차원 전망을하고 빠른 시간 (애플)와 호환되는 동영상 파일로 설정 데이터를 저장합니다. 이러한 방법으로, 우리는 굴지 링하고 시간이지나면서 죽어가는 세포 주위에 발생하는 상피 행동의 수축을 시각화 수 있습니다.
5. 대표 결과
그림 1. apoptotic 세포 압출의 도식. 굴지의 필라멘트가 빨간색으로 표시됩니다, GFP 긍정적인 표피 세포는 녹색입니다.
그림 2. 실험 워크플로우. 실험에 대한 흐름의 A.의 도식. B. GFP zebrafish : 4dpf CK의 표피에 RFP - UtrCH 표현.
그림 3. 아직도 상피 세포 압출의 과정 라이브 굴지 역학을 다음과 시간 경과 영화에서 프레임 (Z - 계획안). 화살표 2 분 과정을 통해 계약하고 닫습니다 인접 세포에 의해 형성 굴지의 반지를 상징.
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Discussion
여기에서 설명한 프로토콜은 실제 상피 조직에서 압출하는 과정을 시각화하는 간단하고 직접적인 방법을 보여줍니다. 이런 유형의 실험은 우리가 이전에 고정 조직 분석에서 평가하지 굴지 역학 미묘을 확인하실 수 있습니다, 따라서, 일반적인 immunofluorescent 방법을 보완합니다. 로 우리는 더 염증 반응이나 손상된 세포의 축적으로 이어질 것입니다 우리가 기대 apoptotic 세포를 제거하고 취소하고 실패와 관련된 압출 과정과 학습 질병 상태를 분석 화학 억제제 또는 유전자 돌연변이와 함께이 프로토콜을 사용할 수 있습니다 암에서 본. 예를 들어, 저희 연구실은 이전에 화학 억제제가 방향 세포는 extrudes 3 효과 세포의 basolateral 표면을 따라 굴지의 필라멘트의 타겟팅을 변경할 수 G418와 함께 사용할 수 나타났습니다. 현재 방법 중 하나 제한이 세포 사망의 확률과 예측 불가능한 자연으로 인해 우리의 데이터 세트는 압출의 나중 단계에 집중하는 경향이있다. 다세포 굴지 링과 수축의 개시의 형성을 연구하기 위해, 이후의 실험은 유전자 세포 사망 10 타겟으로하는 찬란 - 분류 상피 세포의 일부에서 apoptosis를 유도 기술을 적용됩니다. 표피에있는 이미지 굴지 역학에 우리의 방법이 전략을 결합하는 것은 apoptotic 세포 압출로 이어지는 초기 단계의 연구를 촉진해야합니다. 함께,이 실험에서 얻은 정보는 상피 세포의 압출 및 의료 중요성에 대한 우리의 이해에 크게 추가합니다.
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Disclosures
동물 복지 보증
zebrafish, Danio rerio를 사용하여이 절차를 수행 모든 절차는 기관 동물 케어 승인 및 (동물 복지 보증 # 10-07017) 유타 대학위원회 (IACUC)를 사용하고 있습니다.
Acknowledgments
우리는 과학적인 토론, 제안 및 의견에 대한 Rosenblatt 연구소의 회원 감사합니다. GFP 유전자 변형 zebrafish : 우리는 또한 친절 CK를 제공하는 플라스미드 인코딩 RFP - UtrCH와 데이비드 그런왈드를 제공 메리 할로란 감사하고 싶습니다. 감사합니다 또한 그레첸 왕의 zebrafish 우수 유지 보수 및 관리를위한 유타 대학에서 중앙 Zebrafish 자원의 직원. 이 작품은 JR을 OD002056 - 01 DP2 NIH - NIGMS NIH 원장의 새로운 이노 상 1 지원했다. GTE는 NIH 종합 암 교육 프로그램 그랜트 5T32 CA03247 - 8에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
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- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
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