Summary
Las células que mueren son expulsados de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.
Abstract
Mantenimiento homeostático de los tejidos epiteliales requiere la eliminación continua de las células dañadas sin afectar la función de barrera. Nuestros estudios han encontrado que las células que mueren enviar señales a sus vecinos en vivo para formar y contratar a un anillo de actina y miosina que se expulsa hacia fuera de la hoja epitelial al cerrar las lagunas que pudiera haber resultado de su salida, un proceso llamado extrusión de la celda 1. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. Aquí se describe un método para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra. Para visualizar la extrusión, se inyecta una sonda roja de la proteína fluorescente etiquetados para la F-actina en los embriones de una célula etapa pez cebra transgénico que expresa la proteína verde fluorescente en la epidermis e inducir la apoptosis mediante la adición de G418 para las larvas. A continuación, el uso del tiempo-lapse de imágenes en un microscopio confocal de disco giratorio para observar la dinámica de actina y los comportamientos de las células epiteliales durante el proceso de extrusión celular por apoptosis. Este enfoque nos permite investigar el proceso de extrusión en vivo epitelio y proporcionar una vía para estudiar los estados de enfermedad causada por la falta de eliminación de células apoptóticas.
Protocol
Flujo de trabajo básico para la visualización de la dinámica de actina durante la extrusión celular en la epidermis del pez cebra en desarrollo
La epidermis del pez cebra en desarrollo se compone de dos capas distintas, la capa superficial (o peridermis) y una capa basal de células que en contacto con la membrana basal 2. Las células de la capa superficial externa someten a la apoptosis y se eliminan de los tejidos por extrusión 3 (Figura 1). Para visualizar este proceso en tiempo real, se inyecta el ARN que codifica la proteína fluorescente de color rojo unido al dominio de homología calponin de utrofina, una proteína de unión actina (RFP-UtrCH) 4,5, en una de las células etapa pez cebra transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP ) bajo el epitelio estratificado promotor citoqueratina 8 6 (Figura 2A). A pesar de RFP-UtrCH se expresó doquier en los animales después de la inyección de ARN, que se centran en las células superficiales epidérmicas que expresan tanto las buenas prácticas agrarias y RFP para seguir la dinámica de actina en concreto en la epidermis (Figura 2B). A continuación, el tratamiento de las larvas con G418 para inducir extrusión celular por apoptosis y la imagen de los filamentos de actina y la epidermis con un microscopio confocal de disco giratorio y adquirir bases de datos 4D.
Antes de iniciar el experimento
- In vitro transcribir el ARN a partir de una plantilla de ADN lineal con el mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) y purificar el ARN tope utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen). Diluir el ARN a ~ 60ng/ul con agua estéril, hacer 3-5μl alícuotas y almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para la inyección. Nota: Evite congelar repetitivas / descongelación para impedir la degradación del ARN.
- Hacer un molde para mantener los embriones durante la inyección mediante el vertido de 40 ml de agarosa al 2% en medio de embriones E3 (E3) en una placa de 100 x 15 mm cultura y la colocación de un molde de microinyección (Adaptive Herramientas de Ciencia, # I-34) en esta bandeja. Una vez que la agarosa se ha solidificado, retirar el molde para exponer los senos de la agarosa. Guarde la placa a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
- Tire las agujas de inyección capilar para el uso de vidrio de borosilicato con filamentos (OD 1,0 mm, 0,78 ID, longitud 10 cm) y un Sutter P-97 Extractor de una pipeta en los siguientes valores (Heat 485, Tire 50, Velocidad 60, Delay / Hora 90, de presión 200 ). Nota: Los diferentes tipos de vidrio se requiere la optimización de las condiciones mencionadas.
- Representan el 1% de baja fusión (LM) de agarosa en E3 y almacenar alícuotas de 1 ml a 42 ° C. Ten cuidado ya que la evaporación del E3 de las reservas puede aumentar la concentración de agarosa.
- Mantener el pez cebra adulto en condiciones de laboratorio estándar, con un regular de luz / oscuridad ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad 7. La noche antes de la configuración del experimento los peces a su compañero mediante la colocación de 3 mujeres y 2 hombres en un tanque separados por un divisor. A la mañana siguiente, cambiar el agua en el tanque y sacar el divisor cuando las luces se encienden.
1. La inyección de ARN que codifica la proteína actina marcado con fluorescencia Encuadernación
- Descongele el ARN en el hielo. Añadir un 0,5% de rojo fenol al ARN en una proporción de 1:1 para una final de la concentración de ARN del ~ 30ng/μl y la carga de solución 1μl en una aguja capilar tiró por atrás de llenado.
- Recoge un ~ 75 células etapa 8 CK: embriones GFP en el E3. Pipeta de la recogida de embriones en el molde de la microinyección con una pipeta Pasteur 5 ¾ y orientar suavemente los embriones en el canal con FST Dumont # 5 fórceps. Nota: Tenga cuidado al trabajar con rapidez para evitar la inyección en un embrión en su fase de varias celdas, lo cual puede resultar en la expresión del mosaico de la ARN inyectada.
- Bajo un microscopio estereoscópico estándar de laboratorio de disección, se inyecta el ARN en la yema de los embriones con un microinyector controlada por presión (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-inyector). Un punto rojo (rojo fenol) debe ser visible en el embrión después de la inyección. Inyectar por lo menos 50 embriones para cada experimento. (Vea el protocolo JoVe anterior para un protocolo detallado de inyección de ARN en embriones de pez cebra 9). Nota:
- Un volumen de ~ 2NL se debe utilizar para la inyección de ARN en una célula de embriones etapa. Para determinar la cantidad de ARN inyectado, prescindir de un bolo de la ARN en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de micrómetro calibrado o con un microscopio con una barra de escala construido por los oculares. La gota de la ARN debe ser una esfera perfecta. Calcular la cantidad entregada por medio de la ecuación: Volumen (en nl) = 4/3πr 3. Ajustar el volumen entregado por el cambio de la presión de inyección o el tiempo en el instrumento.
- También se deberían tomar para inyectar la menor cantidad de ARN que permite la visualización del fluoróforo, como altas concentraciones de ARN pueden ser tóxicos para el embrión en desarrollo. Para determinar el nivel de expresión apropiado, un experimento de dosis de la curva se debe realizar antes de ejecutar el experimento. </ Li>
- Clasificar los embriones para eliminar los huevos no fertilizados o dañadas y colocar todos los embriones sobrantes a 28,5 ° C.
- Después de 24 horas, usar un microscopio de fluorescencia de disección para seleccionar embriones de pez cebra que tienen un alto nivel de las buenas prácticas agrarias (epidermis) y la fluorescencia de RFP (actina). Colocar los embriones seleccionados a 28,5 ° C hasta que esté listo para proceder con el tratamiento con fármacos para inducir la apoptosis.
2. La inducción de la extrusión celular en larvas de pez cebra con G418
Hemos encontrado que la exposición al antibiótico aminoglucósido G418, o geneticina, provoca la apoptosis y la extrusión de las células epidérmicas en el desarrollo de larvas de pez cebra 3 por un mecanismo desconocido. Es importante destacar que este tratamiento sólo funciona en las larvas que son cuatro días después de la fecundación en adelante. Nos encontramos con que ~ 25.5 células pueden encontrarse en la extrusión en un momento dado de la aleta epitelial del G418 tratados larvas de pez cebra. Como la cantidad de células apoptóticas extrusión puede variar de un pez a, le recomendamos el montaje de pescado múltiples imágenes.
- Recoger y colocar cuatro días después de la fertilización (dpf) larvas de pez cebra exhibiendo las buenas prácticas agrarias y RFP de fluorescencia en una placa de 35 x 10 mm de la cultura que contiene 3 mililitros (ml) de la E3. Uno puede tratar hasta 25 larvas en esta placa de cultivo de tamaño.
- Vuelva a colocar cuidadosamente los medios de comunicación con 3mLs de 1mg/ml E3 que contiene larvas de G418 y se incuban en el medicamento durante 4 horas a 28,5 ° C. Tenga en cuenta que G418 es sensible a la luz, así que tenga cuidado para mantener la placa de cultivo cubierto o en la oscuridad.
- Eliminar los medios de comunicación y reemplazarlos con pre-calentado 28,5 ° C E3 Media que contiene 0,02% tricaína y proceder a la fijación de las larvas.
3. Las larvas de pez cebra de montaje de imágenes
- La transferencia de 3 larvas de un tubo eppendorf de 1,5 ml y eliminar la mayor parte de la E3 después de que el disipador de peces hasta el fondo del tubo. Hemos encontrado que hasta el 3 animales puede ser montado correctamente antes de la agarosa solidifica.
- Usando una punta de pipeta corte, 120ul pipeta de 1% de agarosa LM-(42 ° C) en el tubo, mezclar, y luego una pipeta suavemente las larvas y la mezcla de agarosa en el cubre objetos en el fondo de una placa de cultivo MatTek.
- Utilizando un soporte FST pin con una clavija de inserción o de aguja de tungsteno, orientar rápidamente las larvas por lo que son rectos y planos contra el cubre objetos del plato MatTek.
Nota: Se suelen usar un alfiler para orientar primero la larva y luego un pin en forma de L para asegurarse de que son planas contra el cubre objetos, mientras que la prevención de daños a los especímenes. - Una vez que la agarosa se ha solidificado, vierta el plato con la E3 que contiene 0,02% tricaína. Nota: Como alternativa, G418 se puede agregar a la E3 en el plato de imagen para seguir la inducción de la extrusión, aunque a largo plazo la exposición a 1mg/ml G418 va a matar a las larvas.
4. Imágenes en directo de la dinámica de actina y los comportamientos individuales células epiteliales durante la extrusión celular utilizando un microscopio confocal de disco giratorio
Hemos encontrado que todo el proceso de extrusión celular apoptótica de la epidermis de desarrollo de larvas de pez cebra se tarda aproximadamente 20 minutos 3. Aquí se demuestra cómo configurar un experimento de time-lapse para recoger una serie de planos z a través de una sola capa de la epidermis del pez cebra para visualizar el proceso de extrusión. Hemos encontrado que la típica de los microscopios de campo amplio fluorescentes causa importante photobleaching de los filamentos de actina y no permiten obtener imágenes timelapse. Por lo tanto, para maximizar nuestra resolución y prevenir photobleaching, se utiliza un microscopio confocal de disco giratorio. A continuación se describe cómo configurar el experimento usando el software IQ Andor con un microscopio Nikon, aunque los principios que se discuten se pueden aplicar a microscopio similares set-ups.
- En primer lugar, a su vez en el argón (para la excitación de las buenas prácticas agrarias en 488 nm) y HeNe (para la excitación de la RFP a 561nm) láser, microscopio, cámara y la lámpara de epifluorescencia.
- Dentro del software Andor IQ (versión 1.10.1), crear un protocolo de series de tiempo que contiene las longitudes de onda que desee a la imagen, la frecuencia de los intervalos entre las capturas de imágenes y el número de veces de la captura se debe repetir.
- Con cuidado, coloque el plato que contiene MatTek su muestra en la platina del microscopio y el uso de un objetivo de 20x con luz transmitida a centrarse en las larvas.
- Mueva el objetivo de inmersión en agua 40 veces (NA 0,8) en la posición correcta. El uso de este objetivo, podemos filmar aproximadamente 20 a 25 células por campo, lo que nos permite seguir los comportamientos celulares durante la extrusión a la vez que la resolución subcelular dinámica de la actina. Nota: El montaje mismo y las estrategias de imagen se pueden aplicar a microscopios verticales, aunque un objetivo de inmersión en agua 40 veces con una distancia de trabajo debe ser utilizado.
- Con cuidado, coloque una gota de agua en la parte superior del objetivo de 40x y poner rápidamente el plato MatTek en la parte superior. Noe: Zeiss solución de inmersión Immersol también se puede utilizar si la evaporación del agua es un problema.
- Identificar la muestra con la fase o la iluminación DIC y luego usar epifluorescencia 488nm para centrarse específicamente en la epidermis GFP positivos.
- Cambiar al modo confocal de barrido. Ajustar la intensidad del láser y el tiempo de exposición para cada uno de los canales (488nm y 561nm) en consecuencia. Tenga cuidado de equilibrar la potencia del láser y el tiempo de exposición para la detección óptima de la señal y evitar que se photobleaching o toxicidad.
- Para identificar las células de extrusión, el uso de epifluorescencia para visualizar la GFP etiquetados epidermis e identificar a un grupo de células en un patrón de roseta clásico, que consiste en un conjunto de células que rodean una pequeña celda redonda en el centro. Usando el modo confocal de barrido, también debería ser una acumulación de la actina RFP marcado visible como un anillo alrededor de la célula pequeña y redonda en el medio, un sello distintivo de la extrusión de la célula. Una vez que haya identificado una célula de extrusión, configurar rápidamente el microscopio para adquirir 4D (XYZ-Time) datos confocal.
- Establecer los puntos superior e inferior en el plano z para visualizar una sola capa de la epidermis, incluida la celda de extrusión, y seleccionar el tamaño del paso. Por lapso de tiempo de imágenes, ajustar los intervalos de captura de imágenes y el número de repeticiones. Por ejemplo, adquieren una z-series que abarcan 5-10μm, con un tamaño de micras un paso, cada 1-2 minutos durante 30 minutos.
- Para ver los datos, que suelen hacer las proyecciones 3-D de la serie Z y guardar el conjunto de datos como un archivo de película que es compatible con QuickTime (Apple). De esta manera, podemos visualizar la contracción del anillo de actina y los comportamientos epiteliales que se producen alrededor de la célula que muere con el tiempo.
5. Resultados representante
Figura 1. Esquema de la extrusión de las células apoptóticas. Los filamentos de actina se muestran en rojo, las células epidérmicas de GFP positivos son de color verde.
Figura 2. Flujo de trabajo experimental. A. Esquema del flujo de trabajo para el experimento. B. Expresión de la RFP-UtrCH en la epidermis de un CK 4dpf: GFP pez cebra.
Figura 3. Sin embargo marcos (z-proyecciones) de una película de lapso de tiempo que sigue viva la dinámica de actina durante el proceso de extrusión de las células epiteliales. Las flechas indican el anillo de actina formado por las células vecinas que se contrae y se cierra en el transcurso de 2 minutos.
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Discussion
El protocolo se describe aquí se muestra un método simple y sencillo de visualizar el proceso de extrusión en un tejido epitelial en vivo. Este tipo de experimento nos permite examinar las sutilezas de la dinámica de actina no se había supuesto en los análisis de tejidos fijados, y por lo tanto, complementa los métodos comunes de inmunofluorescencia. Podemos utilizar este protocolo en combinación con inhibidores químicos o mutantes genéticos para analizar mejor el proceso de extrusión y los estados estudiar las enfermedades asociadas con la falta de quitar y limpiar las células apoptóticas, que esperamos llevar a respuestas inflamatorias o la acumulación de células dañadas, como visto en el cáncer. Por ejemplo, nuestro laboratorio ha demostrado previamente que los inhibidores químicos pueden ser utilizados en combinación con G418 para modificar la orientación de los filamentos de actina a lo largo de la superficie basolateral de la célula, que los efectos de la dirección de una celda de extrusión de 3. Una de las limitaciones del método actual es que, debido a la naturaleza estocástica e impredecible de la muerte celular, nuestras bases de datos tienden a concentrarse en las últimas etapas de la extrusión. Para estudiar la formación del anillo de actina multicelulares y el inicio de la contracción, los experimentos futuros se aplicarán las técnicas para inducir la apoptosis en un subgrupo de fluorescencia marcado células epiteliales que son genéticamente blanco de la muerte celular 10. La combinación de esta estrategia con nuestro método de imagen dinámica de la actina en la epidermis debe facilitar los estudios de los primeros pasos que conducen a la extrusión de las células apoptóticas. En conjunto, la información obtenida de estos experimentos aumentará significativamente nuestra comprensión de la extrusión de las células epiteliales y su importancia médica.
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Disclosures
Garantía de bienestar de los animales
Todos los procedimientos realizados en el presente protocolo con el pez cebra, Danio rerio, han sido aprobados por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Utah (Aseguramiento de Bienestar Animal # 10-07017).
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio Rosenblatt para los debates científicos, sugerencias y comentarios. También nos gustaría agradecer a María Halloran, quien amablemente proporcionó el plásmido que codifica RFP-UtrCH Grunwald y David, que siempre que el CK: GFP pez cebra transgénico. Gracias también a Gretchen Rey y el personal de los recursos de pez cebra centralizada en la Universidad de Utah para el mantenimiento de una excelente y el cuidado del pez cebra. Esta labor fue apoyada por Premio a la Innovación de Nueva NIH-NIGMS director de los NIH de un DP2 OD002056-01 a JR. GTE fue apoyado por el NIH Multidisciplinario del Cáncer Programa de Capacitación 5T32 subvención CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
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