Summary
Döende celler extruderade från epiteliala vävnader genom samordnad kontraktion av angränsande celler utan att störa barriärfunktion. Den optiska klarhet utveckla zebrafisk ger ett utmärkt system för att visualisera extrudering i levande epitel. Här beskriver vi metoder för att framkalla och bild extrudering i larvernas zebrafisk överhuden på cellulär upplösning.
Abstract
Homeostatiska underhåll av epitelvävnader kräver kontinuerlig avlägsnande av skadade celler utan att störa barriärfunktion. Våra studier har visat att döende celler skickar signaler till sina bo grannar att bilda och kontrakt en ring av aktin och myosin som matas ut från epitelceller arket medan utgående eventuella luckor som kan ha resulterat från dess utgång, kallas en process cell extrudering 1. Den optiska klarhet utveckla zebrafisk ger ett utmärkt system för att visualisera extrudering i levande epitel. Här beskriver vi en metod att framkalla och bild extrudering i larval zebrafisk epidermis. Att visualisera extrudering, injicera vi en röd fluorescerande proteinet märkt probe för F-aktin i en-cells stadiet transgena zebrafisk embryon uttrycker grönt fluorescerande protein i epidermis och inducera apoptos genom tillsats av G418 till larver. Vi använder sedan tidsförlopp avbildning på en snurrande skiva konfokalmikroskop att observera aktin dynamik och epitelceller beteenden cell under arbetet med apoptotiska celler extrudering. Detta tillvägagångssätt tillåter oss att undersöka extruderingsprocessen i levande epitel och ger en aveny för att studera sjukdomar som orsakas av underlåtenhet att eliminera apoptotiska celler.
Protocol
Grundläggande arbetsflöde för visualisering av Actin Dynamics Under Cell Extrudering i epidermis av utvecklingsländer Zebrafish
Överhuden utvecklingsländernas zebrafisk består av två olika skikt, ytskiktet (eller periderm) och en basal lager av celler som kontaktar basalmembranet 2. Cellerna i det yttre ytskiktet genomgå apoptos och elimineras från vävnaden genom extrudering 3 (Figur 1). Att visualisera denna process i realtid, injicera vi RNA kodar röda fluorescerande proteinet smält till calponin homologi domän utrophin, en aktin bindande protein (RFP-UtrCH) 4,5, i en-cells stadiet transgena zebrafisk uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP ) under den stratifierade epitel initiativtagaren Cytokeratin 8 6 (Figur 2A). Även RFP-UtrCH är ubiquitously uttryck i djur efter RNA injektion, fokuserar vi på ytliga epidermala celler som uttrycker både RFP och GFP följa aktin dynamik specifikt i överhuden (Figur 2B). Vi behandlar sedan larverna med G418 att framkalla apoptotiska celler extrudering och bild epidermis och aktin filament med en snurrande skiva konfokalmikroskop och skaffa 4D datamängder.
Före start av Experiment
- In vitro transkribera RNA från en linjär DNA-mall med mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) och rena tak RNA med RNeasy Mini Kit (Qiagen). Späd RNA till ~ 60ng/ul med sterilt vatten, göra 3-5μl alikvoter och förvara vid -80 ° C tills klar för injektion. Obs: Undvik upprepad frysning / tining för att förhindra nedbrytning av RNA.
- Gör en form för att hålla embryon under injektion genom att hälla 40 ml 2% agaros i E3 embryo medium (E3) i en 100 x 15mm kultur tallrik och placera en mikroinjektion mögel (Adaptive Science Tools, # I-34) i det här facket. När agarosen stelnat, ta bort mögel att exponera dalar i agaros. Förvara plattan vid 4 ° C tills redo att användas.
- Dra kapillär nålar för injektion med borosilikatglas med filament (OD 1,0 mm, ID 0,78, 10cm längd) och en Sutter P-97 Pipettera Avdragare vid följande inställningar (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay / tid 90, Tryck 200 ). Anm: Olika typer av glas kräver optimering av det som räknas.
- Späd 1% Låg Melt (LM) agaros i E3 och lagra 1 mL alikvoter vid 42 ° C. Var försiktig så avdunstning av E3 från bestånden kan öka agarosen koncentrationen.
- Behåll vuxna zebrafisk under normala laboratorieförhållanden med en vanlig ljus / mörker-cykel med 14 timmar ljus och 10 timmar mörker 7. Kvällen innan experimentet inrättat fiskar att para sig genom att placera tre kvinnor och två män i en tank åtskilda av en skiljevägg. Nästa morgon, byta vatten i tanken och dra skiljelinjen när ljuset tänds.
1. Injektion av RNA som kodar för fluorescerande taggade Actin Binding Protein
- Tina RNA på is. Tillsätt 0,5% Fenolrött till RNA i förhållandet 1:1 för en slutlig RNA-koncentration av ~ 30ng/μl och last 1μl lösningen till en drog kapillär nålen genom back-fyllning.
- Samla ~ 75 en-cells stadiet 8 CK: GFP embryon i E3. Pipettera de insamlade embryon till mikroinjektion mögel med en 5 ¾ Pasteurpipett och försiktigt orientera embryona i tråget med FST Dumont # 5 pincett. Obs: Var noga med att arbeta snabbt för att undvika att injicera i en multi-cell skede embryo, vilket kan resultera i mosaik uttryck av den injicerade RNA.
- Enligt en standard laboratorium dissekera stereomikroskop, injicera RNA i äggulan av embryon med hjälp av en tryck-microinjector (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-injektor). En röd fläck (fenolrött) ska synas i embryot efter injektionen. Injicera minst 50 embryon för varje experiment. (Se föregående JUPITER-protokollet för ett detaljerat protokoll på RNA injektion i zebrafisk embryon 9). Anmärkning:
- En volym av ~ 2nl ska användas för injektion av RNA i en-cells embryon skede. För att fastställa beloppet av RNA injiceras, avstå en bolusdos av RNA till en droppe mineralolja på en kalibrerad mikrometer bild eller i mikroskop med en skala bar inbyggd i okularen. Droppen av RNA bör vara en perfekt sfär. Beräkna mängden som levereras med hjälp av ekvationen: Volym (i NL) = 4/3πr 3. Justera volymen levereras genom att ändra insprutningstryck eller tid på instrumentet.
- Försiktighet bör också vidtas för att injicera det lägsta belopp av RNA som tillåter visualisering av fluoroforen, eftersom höga halter av RNA kan vara toxiska för det växande embryot. Att fastställa lämpliga uttryck nivå bör en dos-kurva experiment göras innan du kör experimentet. </ Li>
- Sortera embryon för att ta bort obefruktade eller skadade ägg och placera alla kvarvarande embryon vid 28,5 ° C.
- Efter 24 timmar, väljer du en fluorescerande dissekera mikroskop för att välja zebrafisk embryon som har en hög nivå av GFP (överhuden) och RFP (aktin) fluorescens. Placera utvalda embryona vid 28,5 ° C tills den ska gå vidare med läkemedelsbehandling att inducera apoptos.
2. Induktion av Cell Extrudering i Zebrafish Larver med hjälp av G418
Vi har funnit att exponering för aminoglykosid antibiotika G418 eller Geneticin, orsakar apoptos och extrudering av epidermala celler i u zebrafisk larver 3 av en okänd mekanism. Viktigt fungerar denna behandling bara på larver som är 4 dagar efter befruktningen och äldre. Vi finner att ~ 5-25 celler finns strängpressning vid varje given tidpunkt från fenan epiteliala av G418 behandlas larver zebrafisk. Eftersom mängden apoptotiska strängpressning celler kan variera från fisk till fisk, rekommenderar vi montering av flera fiskar för avbildning.
- Samla in och placera 4 gödsling dagen efter (DPF) zebrafisk larver uppvisar både GFP och RFP fluorescens in i en 35 x 10mm kultur maträtt innehåller 3 milliliter (MLS) i E3. Man kan behandla upp till 25 larver i den här storleken kultur maträtt.
- Sätt på det media med 3mLs av E3 innehåller 1mg/ml av G418 och inkubera larver i drogen i 4 timmar vid 28,5 ° C. Observera att G418 är ljuskänsligt, så ta hand för att hålla kulturen skål täckt eller i mörker.
- Ta bort media och ersätt med förvärmda 28,5 ° C E3 media som innehåller 0,02% Tricaine och gå vidare till montering av larver.
3. Montering Zebrafish Larver för bildbehandling
- Överföring 3 larver till ett 1,5 ml Eppendorf-rör och ta bort de flesta av E3 efter att fisken sjunker till botten av röret. Vi har funnit att upp till 3 djur på rätt sätt kan monteras innan agarosen stelnar.
- Använda ett snitt pipettspetsen, Pipettera 120ul 1% LM-agaros (42 ° C) i röret, blanda, och sedan försiktigt pipettera larverna och agarosen blandningen på coverglass i botten av en Mattek kultur maträtt.
- Med hjälp av en FST stift hållare med en in nål eller volfram kanylen påsatt, snabbt orientera larverna så de är rakt och platt mot coverglass av Mattek skålen.
Obs: Vi använder vanligtvis en rak stift att först orientera larverna och sedan en L-formad pin för att säkerställa att de är platt mot coverglass samtidigt förhindra skador på prov. - När agarosen stelnat försiktigt fyll skålen med E3 som innehåller 0,02% Tricaine. Obs: Alternativt kan G418 läggas till E3 i bildbehandling maträtt att fortsätta framkalla extrudering, även om långvarig exponering för 1mg/ml G418 kommer att döda larverna.
4. Live avbildning av Actin Dynamics och Individuella Epithelial Beteenden Cell Under Cell Extrudering med en snurrande skiva konfokalmikroskop
Vi har funnit att hela processen med apoptotiska celler extrudering från epidermis att utveckla zebrafisk larver tar ungefär 20 minuter 3. Här visar vi hur du ställer in ett tidsförlopp imaging experiment för att samla en rad av z plan genom ett enda lager av zebrafisk överhuden för att visualisera extruderingsprocessen. Vi har funnit att typiska widefield fluorescerande mikroskop orsaka betydande fotoblekning av aktin filament och inte tillåter Timelapse avbildning. Därför att maximera vår resolution och förhindra fotoblekning använder vi en snurrande skiva konfokalmikroskop. Nedan beskriver vi hur du ställer in experimentet med Andor IQ mjukvaran med en Nikon mikroskop, men diskuterade principer kan tillämpas på liknande mikroskop uppställningar.
- Först sätter du på Argon (för excitation av GFP vid 488nm) och HeNe (för excitation av RFP vid 561nm) lasrar, mikroskop, kamera och epifluorescent lampa.
- Inom Andor IQ (version 1.10.1), skapa ett protokoll tidsserie innehåller de våglängder som du vill bilden, fånga frekvensen av intervallerna mellan bild fångar och tiderna numret ska upprepas.
- Placera försiktigt Mattek skålen med dina prov på mikroskop scenen och använder ett 20x objektiv med ljus för att fokusera på larverna.
- Flytta 40X målet nedsänkning i vatten (NA 0,8) i rätt läge. Med denna målsättning kan vi filma cirka 20-25 celler per område, vilket ger oss möjlighet att följa cellulära beteenden vid extrudering och samtidigt lösa sub-cellulära aktin dynamik. Anm: Samma montering och bildbehandling strategier kan tillämpas på upprätt mikroskop, men en 40X nedsänkning i vatten mål med en lång arbetsdag avstånd skall användas.
- Placera försiktigt en droppe vatten på toppen av 40x objektiv och snabbt placera Mattek skålen ovanpå. Intee: Zeiss Immersol nedsänkning lösning kan också användas om avdunstning av vatten är ett problem.
- Identifiera prov med fas eller DIC belysning och sedan använda 488nm epifluorescence att fokusera specifikt på GFP positiva epidermis.
- Växla till konfokal skanning läge. Justera lasern intensitet och exponeringstid för de kanaler (488nm och 561nm) i enlighet därmed. Var noga med att balansera lasereffekten och tid för exponering för optimal detektering av din signal och att förhindra fotoblekning eller toxicitet.
- Att identifiera strängpressning celler använder epifluorescence att visualisera GFP märkt epidermis och identifiera en grupp av celler i en klassisk rosett mönster, bestående av en samling celler som omger ett litet runt cellen i mitten. Använda konfokal scanning läge, bör det också finnas en ackumulering av RFP-märkta aktin syns som en ring runt den lilla runda cellen i mitten, ett kännetecken för cell extrudering. När du har identifierat en strängpressning cell, snabbt ställa in mikroskopet att förvärva 4D (XYZ-Time) konfokala datamängder.
- Ställ in den övre och undre punkter inom z planet att visualisera ett enda lager av överhuden, inklusive strängpressning cellen och välj steglängd. För tidsförlopp imaging, ställ in intervall för bild fånga och antal repetitioner. Till exempel, förvärva vi vanligtvis en Z-serie som spänner över 5-10μm, med en 1 mm steg storlek, var 1-2 minuter i 30 minuter.
- Att visa data gör vi vanligtvis 3-D prognoser av Z-serien och spara datamängden som en filmfil som är kompatibel med Quick Time (Apple). På detta sätt kan vi visualisera sammandragning av aktin ringen och epiteliala beteenden som sker runt den döende cellen över tiden.
5. Representativa resultat
Figur 1. Schematisk av apoptotiska celler extrudering. Aktin filament visas i rött, GFP positiva epidermala celler är gröna.
Figur 2. Experimentell Workflow. A. Schematisk av arbetsflödet för experimentet. B. Redovisning av RFP-UtrCH i överhuden en 4dpf CK: GFP zebrafisk.
Figur 3. Stillbilder (z-prognoser) från en time-lapse film som följer lever aktin dynamik under processen för epitelceller extrudering. Pilar betecknar ringen av aktin bildas av angränsande celler vilka avtal och stänger under loppet av 2 minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här visar på en enkel och okomplicerad metod för att visualisera processen av extrudering i en levande epitelvävnad. Denna typ av experiment tillåter oss att undersöka nyanser av aktin dynamik som inte tidigare uppskattat i fast vävnad analyser, och därför kompletterar gemensamma immunofluorescens metoder. Vi kan använda detta protokoll i kombination med kemisk-hämmare eller genetiska mutanter att bättre analysera extruderingsprocessen och studera stater sjukdom i samband med underlåtenhet att ta bort och rensa apoptotiska celler, som vi räknar med kommer att leda till inflammatoriska reaktioner eller ansamling av skadade celler, som ses i cancer. Till exempel har vårt laboratorium visat tidigare att kemisk hämmare kan användas i kombination med G418 att ändra inriktningen av aktin filament längs basolateral cellytan, vilka effekter den riktning som en cell extruderar 3. En begränsning till den nuvarande metoden är att på grund av stokastiska och oförutsägbara karaktären av celldöd, vårt dataset tenderar att fokusera på de senare stadierna av extrudering. Att studera bildandet av flercelliga aktin ringen och initiering av kontraktion kommer framtida experiment använda teknik för att inducera apoptos i en delmängd av fluorescerande-märkt epitelceller som genetiskt är riktade för celldöd 10. Kombinera denna strategi med vår metod för att bilden aktin dynamik i epidermis bör underlätta studier av de tidiga stegen som leder till apoptotiska celler extrudering. Tillsammans kommer den information de fått från dessa experiment avsevärt öka vår förståelse av epitelceller extrudering och dess medicinska betydelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Djurskydd Assurance
Alla ingrepp i detta protokoll med zebrafisk, Danio rerio, har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Utah (djurskydd Assurance # 10-07.017).
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar av Rosenblatt laboratoriet för vetenskapliga diskussioner, förslag och kommentarer. Vi vill också tacka Maria Halloran som välvilligt lämnat plasmiden kodning RFP-UtrCH och David Grunwald som tillhandahöll CK: GFP transgena zebrafisk. Tack också till Gretchen kung och personalen i den centraliserade Zebrafish Resurs vid University of Utah för utmärkt underhåll och skötsel av zebrafisk. Detta arbete stöddes av NIH-NIGMS NIH direktörens Nya Innovator Award 1 DP2 OD002056-01 till JR. GTE fick stöd av NIH Tvärvetenskaplig Cancer träningsprogram Grant 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
