הסיליקון מיקרוצ'יפים עבור מניפולציה Cell-cell אינטראקציה

Summary

מאמר זה מתאר גישה ניסויית לוויסות דינמי של תא תא אינטראקציות בין תאים חסיד בקנה מידה מיקרומטר. מניפולציה של התקשורת בין אינטר hepatocytes תא סטרומה מודגם. הפלטפורמה שפותחה מאפשרת חקירה של תאים תאים אינטראקציות במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל פיתוח בפתוגנזה.

Abstract

תפקידה של microenvironment הסלולר מוכר מכרעת בקביעת גורל התא ותפקודו כמעט בכל הרקמות יונקים מפיתוח שינוי ממאיר. בפרט, אינטראקציה עם stroma השכנות היה מעורב שפע של תופעות ביולוגיות, עם זאת, טכניקות קונבנציונאלי להגביל את היכולת לחקור את האלמנטים מרחבית דינמית של אינטראקציות כאלה.

בתרבות Reconfigurable micromechanical (RC), אנחנו מעסיקים מצע סיליקון micromachined עם חלקים נעים באופן דינמי לשלוט תאים תאים אינטראקציות דרך מחדש מכני. קודם לכן, שיטה זו יושמה כדי לחקור תקשורת אינטר ב שיתוף תרבויות hepatocytes ולא parenchymal תאים, הוכחת תלוי זמן אינטראקציות מגוון מצומצם של איתות מסיסים ^1.

כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הכנת השימוש במערכת RC. אנחנו מתחילים ידי הוכחת את הטיפול חלקי המכשיר באמצעות פינצטה, כולל actuating הפער בין תצורות קשר (אוכלוסיות תאים המופרדים פער של 80 מיקרומטר צרים, או במגע ישיר). הבא, אנחנו בפרוטרוט את תהליך הכנת מצעים לתרבות, ואת רב שלבי תהליך זריעת תא הנדרש לקבלת monolayers תא ומחוברות. באמצעות מיקרוסקופ לחיות, אז אנחנו להמחיש בזמן אמת מניפולציה של תאים בין תצורות שונות ניסיוני אפשרי. לבסוף, אנו מדגימים את הצעדים הנדרשים על מנת לחדש את פני המכשיר לשימוש חוזר: טולואן וניקוי פיראניה, ציפוי קלקר, פלזמה טיפול חמצן.

Protocol

הכנת תרביות תאים:

1. התחל עם חלקים סיליקון מצופה קלקר פלזמה שטופלו.
2. מעיל עם חלקים המתאימים חלבונים תאי מטריקס לתמוך מצורף מסוג התא הרצוי. עבור hepatocytes, דגירה בתמיסה 50 גרם / מ"ל ​​קולגן 1 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. עבור fibroblasts 3T3, מטריצה ​​לא נחוץ.
3. נעל חלקים עם חלקים משלימים בתצורת קשר.
4. משרים אתנול 70% עבור מינימום של 10 דקות לעקר. לשטוף 2x ב DDH ₂ O, ו 1x בתקשורת תרבית תאים.
5. זרעים תאים בריכוז של 500,000 תאים / מ"ל ​​במדיום התרבות המתאימה. השתמש ב 1 מ"ל של כל אחד צלחת 12 גם תרבות.
6. דגירה עבור שעה 1, רועד בכל 15 דקות מחדש תאים להשעות באופן שווה.
7. אם monolayer ומחוברות לא הושגה אחרי שעה 1, לשאוב את ההשעיה התא זריעת לחזור עם השעיה חדשה. חזור עד צפיפות התאים הרצוי הושג.
8. הסרת חלקים משלימים. העברת חלקים בארות טריים דגירה לילה כדי לאפשר לתאים לדבוק ולהפיץ באופן מלא.
9. טופס שיתוף תרבויות ידי נעילת חלקים המתאימים לתוך הפער או תצורה קשר. התצורה ניתן לשנות בכל נקודה רצויה במהלך התרבות.
10. בעת שינוי התקשורת, דואגים להשאיר תאים יבש מעט זמן ככל האפשר, רצוי רק שנייה או שתיים. צייר את נוזל ביד אחת מיד להחליף מדיה באמצעות היד השנייה.

עיבוד חלקי סיליקון לשימוש חוזר:

1. רצועת תאים על ידי טבילה אקונומיקה ושטיפה במים.
2. אפשר חלקים להתייבש לחלוטין. משרים טולואן עבור h 2 להפשיט קלקר.
3. נקי בתמיסה פיראניה (01:02 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ מחומם 120 ° C.
4. שטפו במשך 15 דקות תחת זרם מתמשך של DDH ₂ O. אם אתה לא הולך להפקיד פוליסטירן מיד, לאחסן את החלקים במים.
5. ממיסים פוליסטירן ב טולואן ב 100 מ"ג / מ"ל. וורטקס ב פוליפרופילן חרוטי כ 1 שעה, או עד שהיא נמסה לגמרי. קצת יותר מ 1 מ"ל של פתרון נדרש כל 10 חלקים.
6. מעיל ספין פוליסטירן פתרון חלקי סיליקון יחיד בסל"ד 2400 למשך 30 שניות.
7. אופים במשך שעה לפחות 5 ב 120 ° C.
8. פנקו עם פלזמה חמצן (200 mTorr, 200 W) דקות 1.

Discussion

מערכת זו היא ייחודית בכך שהיא מאפשרת את הארגון המרחבי של רקמות כדי לטפל באופן דינמי ברמה התאית. לפיכך, התקן זה איפשר מספר ניסויים ביולוגיים רומן, פורש נושאים כגון דינמיקה איתות אינטר, פנה בתיווך מול איתות מסיסים, גורל החלטות התא, טוקסיקולוגיה, ועל crosstalk הסלולר. מכשיר זה יש להכליל נרחב מאז המצע התרבות היא תרבות רקמות פלסטיק רגיל, והמערכת תואמת שיטות התרבות מבחני סטנדרטי. לפיכך, אנו מאמינים כי פלטפורמה זו יהיה עניין רחב ככלי לחקר תאים תאים האינטראקציה בין תאים שונים ברקמות רבות.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).