Summary
قد PGS السقالات المرنة مع خلايا العضلات الملساء الوعائية المستزرعة في مفاعل حيوي يؤدي إلى تدفق نابض بنيات صغيرة قطرها الشرياني واعدة مع انتاج ECM الأم في فترة قصيرة نسبيا الثقافة.
Abstract
أمراض القلب والأوعية الدموية هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفيات في الولايات المتحدة وخصوصا أمراض الشرايين التاجية يزداد مع شيخوخة السكان وزيادة السمنة 1. حاليا ، سيخضع لعملية جراحية باستخدام السفن ذاتي ، allografts ، وزرع الانسجة الصناعية والمعروفة باسم استخداما ألف لبدائل الشرياني 2. ومع ذلك ، فإن هذه الطعوم لها تطبيقات محدودة عندما القطر الداخلي للشرايين هو أقل من 6 مم بسبب توافر منخفضة ، ومضاعفات الجلطات ، عدم تطابق الامتثال ، وفرط التنسج باطنة أواخر 3،4. للتغلب على هذه القيود ، وقد تم تطبيقها بنجاح هندسة الأنسجة باعتباره بديلا واعدا لتطوير بنيات صغيرة قطرها الشرايين التي nonthrombogenic وقوية ومتوافقة. وقد وضعت العديد من الدراسات السابقة ذات القطر الصغير يبني الشرياني مع ثلاثي صفاحي هيكل وخصائص ميكانيكية ممتازة وضغوط مماثلة لانفجار الشرايين الأصلية 5،6. في حين أن عالية الشد والضغط انفجر عن طريق زيادة إنتاج الكولاجين من مادة جامدة أو خلية سقالة ورقة ، وهذه التركيبات لا تزال منخفضة وكان إنتاج الإيلاستين والامتثال ، والتي تعتبر مشكلة رئيسية في قضية الكسب غير المشروع فشل بعد الزرع. النظر في هذه القضايا ، وافترضنا أن مادة بيولوجية elastometric جنبا إلى جنب مع تكييف الميكانيكية من شأنه أن يوفر المرونة وسلوك الإشارات الميكانيكية أكثر كفاءة للخلايا الأوعية الدموية ، والتي تزيد من إنتاج مصفوفة خارج الخلية ، ودعم التوجه الخلوية.
الهدف من هذا التقرير هو لإدخال تقنية تصنيع السقالات الأنبوبية التي يسهل اختراقها وتكييف دينامية ميكانيكية لتطبيقها في هندسة الأنسجة في الشرايين. استخدمنا الاستومر القابلة للتحلل ، وبولي (sebacate الجلسرين) (PGS) (7) لافتعال السقالات الأنبوبية التي يسهل اختراقها من الملح طريقة الانصهار. وكانت المصنفة الكبار الخلايا الأولية البابون العضلات الملساء (SMCs) على لمعة من السقالات ، والتي صممت لدينا مثقف في مفاعل حيوي تدفق نابض لمدة 3 أسابيع. والسقالات PGS سمك ثابت وتوزيعها عشوائيا الكلي والجزئي المسام. تكييف الميكانيكية من مفاعل حيوي تدفق نابض دعم وتعزيز التوجه SMC ECM الإنتاج في السقالات. هذه النتائج تشير إلى أن السقالات المرنة الميكانيكية وتكييف الثقافة مفاعل حيوي قد يكون وسيلة واعدة لهندسة الأنسجة في الشرايين.
Protocol
1. سقالة أنبوبية التصنيع
- إعداد أنابيب الزجاج (طول = 70 ملم ، القطر الخارجي = 9.0 ملم ، وسماكة الجدار = 1.0 ملم ، وقطع صغيرة ، ميرامار ، فلوريدا) كقالب لسقالة.
- إعداد 1.0 بالوزن / المجلد ٪ حمض الهيالورونيك (HA) (سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO) عن طريق إذابة 100 ملغ من HA في 10 مليلتر من الماء منزوع الأيونات. مزيج باستخدام المدورة بين عشية وضحاها حتى لا توجد فقاعات الهواء في الحل.
- من أجل حل HA 1.0 ٪ في الجزء العلوي من الأنابيب الزجاجية. اتركها تتدفق ببطء على طول الجدار الداخلي للقالب. الوجه خلال الأنابيب عندما حل يتم التوصل اليه من أسفل القالب باستخدام المدورة وكرر هذه الخطوة حتى يتم المغلفة بالتساوي الجدار الداخلي للقالب من الحل.
- بعد طلاء وجافة جميع الأنابيب الزجاجية في فرن الفراغ عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- طحن وجزيئات الملح غربال (حجم = 25-32 ميكرون) تستخدم porogens.
- تجميع أنابيب الزجاج (المغلفة مع 1.0 ٪ داخل HA الحل) ، مغزل (الفولاذ المقاوم للصدأ الأنابيب التي المغطى PTFE) ، تقلص الحرارة الأكمام (HS) ، وصفت بأنها عصابة PTFE سابقا 8.
- إضافة جزيئات الملح من الحجم المطلوب لقالب الزجاج باستخدام ملعقة من خلال القمع والمطاط والسيليكون. اضغط على العفن برفق لضمان التوزيع العادل للجزيئات الملح. كشط جزيئات الملح الزائد في الجزء العلوي من العفن باستخدام جانب من الملعقة.
- بدوره على التهجين حاضنة لمدة 30 دقيقة قبل نقل قالب ملح معبأة. إيقاف الحاضنة التهجين وضعي الملح معبأة العفن في حاضنة التهجين لانصهار الملح.
- إزالة قوالب من الحاضنة التهجين وتجفيفها في الفرن فراغ في 37 لمدة 24 ساعة درجة مئوية
- إزالة قوالب الملح معبأة من الفرن فراغ ، والسماح لهم لتبرد في درجة حرارة الغرفة. إزالة مغزل الفولاذ المقاوم للصدأ التي دفعت به إلى أسفل مع عقد حلقة PTFE. إذا مغزل ضيق جدا من العفن ، واستخدام إبرة لسحب كماشة بها. إزالة خاتم PTFE من الجزء السفلي من العفن.
- وضع القوالب في الفرن على 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ليتقلص HS الأكمام. الاختيار إذا تقلصت HS الأكمام. إزالة الأكمام HS من قوالب الملح معبأة والسماح لهم لتبرد في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ على القوالب في dessicator حتى يتم استخدامها.
- إعداد PGS حل عن طريق إذابة 3 غرام من PGS إلى 15 مل من رباعي هيدرو الفوران (THF) (سيغما الدريخ ، وسانت لويس ، MO) لتشكيل وزن 20 / المجلد الحل ٪.
- إضافة إلى حل PGS لمعة من قوالب الملح معبأة من قبل إسقاطه باستخدام spoid في هود هيوم. العجاف القالب الزجاج عن 45 درجة وإسقاط حل PGS في التجويف الداخلي مع تناوب العفن ببطء. معرفة ما اذا كان الحل PGS يتدفق على طول الجدار من العفن. إذا لوحظ بقعة جافة ، إضافة المزيد من الحل.
- بعد إضافة الحل PGS ، ضع في قوالب هود هيوم لا يقل عن 30 دقيقة للتبخير THF.
- وضع القوالب في الفرن لوقت الفراغ علاج محدد مسبقا (مثلا : 24 / 36 / 48 ساعة) في mTorr 100 و 150 درجة مئوية لمدة PGS علاج.
- بعد المعالجة ، واخراج قوالب وضعها في درجة حرارة الغرفة حتى يبرد. تراجع كل العفن في الماء منزوع الأيونات مع الوضع العمودي ببطء. لا تراجع لهم في المياه بسرعة لأن فقاعات الهواء قد يسبب تمزق السقالة.
- نقل القوالب إلى حمام الماء بعناية ووضعها في زاوية لمدة 1 ساعة باستخدام أنبوب السيليكون لإذابة HA بسهولة. تحقق مما إذا تم حل ها من العفن. إذا لم يتم الإفراج HA من العفن ، ودفع في نهاية واحدة من سقالة ببطء باستخدام ملعقة إلى تحريرها من العفن. كرر هذه الخطوة في الطرف الآخر من سقالة ويهز القالب ببطء ذهابا وإيابا في حمام مائي. تحقق مما إذا تم نقل سقالة داخل القالب.
- نقل إلى أخرى سقالة حمام مائي مع النمام بعناية. لا استيلاء على سقالة بحزم ، والتي قد تشن على سقالة. ضع سقالة في حمام ماء لا يقل عن 3 أيام مع تغيير الماء ليتش من جزيئات الملح.
- بعد الغسل من جزيئات الملح ، ونقل كل سقالة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل مملوءة منزوع الأيونات الماء ووضعها في مربع الجليد الجاف لمدة 1 ساعة إلى التجميد. وضع أنابيب الطرد المركزي في lyophilizer (يجب فتح جميع سيارات الاجرة أنبوب) وlyophilize لهم لمدة 2 ايام.
- تطرح جميع السقالات في dessicator حتى قبل استخدامها.
2. سقالة التحضير للخلية البذر
- أخرج من dessicator السقالات وقطع منها على النحو 30mm - 25 طول.
- إعداد two سدادات المطاط سيليكون (القطر = 20 مم ، سماكة الجدار = 6.35 ملم ، وسط حفرة قطرها = 3 مم) ، وشبكة أنابيب توصيل جهازي PTFE (القطر الخارجي = 3.97 ملم ، وقطرها الداخلي = 2.38 مم ، سماكة الجدار = 0.79 ملم ، وطول = 60 مم و 40 مم) من خلال ثقوب منتصف كل سدادة.
- قطع حلقة HS باعتبارها 1.5 مم طول ووضعها على رأس واحدة من نهاية السقالة. دفع one السليكوون أنابيب (متصلا سيليكون سدادة مطاطية) في انهاء واحدة من سقالة على جزء صغير تداخل ممكن.
- وضع أنابيب السقالة وPTFE في الفرن على 120 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتقليص HS الحلبة. الاختيار إذا تقلصت HS الرنين ويتم توصيل الأنابيب لالسقالات PTFE بحزم.
- إخراج أنابيب السقالة وPTFE ووضعها في درجة حرارة الغرفة حتى يبرد. وضع التجميع أنابيب سقالة - PTFE في الأنبوب البولي (القطر الخارجي = 15.5 ملم ، وقطره الداخلي = 9 ملم ، وطول = 50 ملم) كغرفة مفاعل حيوي.
- توصيل أنابيب أخرى نهاية PTFE إلى سقالة كخطوات 2.3) و 2.4).
- ضبط two سدادات المطاط سيليكون إرفاق سطوحها الداخلية لكلا طرفي أنبوب البولي. نعلق على حد سواء الأسطح الخارجية للسدادات المطاط سيليكون لصفيحتين سبائك الألومنيوم (أعلى وأسفل ؛ العرض = 20 ملم ، وطول = 70 ملم ، وسمك = 6.35 ملم). وضع اثنين من قضبان مترابطة في حفرة جانب لوحة وإصلاح الأنبوب البولي (المضمنة داخل سقالة) لوحات من خلال تشديد المسمار الجوز الإبهام على طبق من ذهب.
- قياس طول كل seedable سقالة (طولها بين عصابات HS اثنين) وحساب مساحة السطح الداخلي (خ خ الداخلية π طول قطرها seedable) من كل سقالة لبذر الخلية.
- التفاف غرفة مفاعل حيوي وحدة واحدة مع رقائق الألومنيوم وتعقيم من قبل التعقيم عند 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تعقيم كل جزء (الخزان المتوسطة ، وأنابيب ضخ ، مبادل الغاز ، والفتحات ، وصمام إبرة) من مفاعل حيوي عن طريق التعقيم على 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتجميعها داخل الخلية هود الثقافة.
- قبل العلاج وشطف السقالات مع سلسلة من perfusions (70 ، 50 ، و 25 ٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة ، والفوسفات مخزنة المالحة (PBS ، Mediatech ، هيرندون ، فرجينيا) لمدة 2 ساعة ، وSMC مستنبت لمدة 24 ساعة باستخدام مضخة تمعجية عند 1.0 مل / دقيقة في الدائرة التدفق.
3. البذر الخلية والثقافة
- عزل الأولية الشرياني خلايا العضلات الملساء (SMCs) من الشرايين السباتية من قردة البابون الذكور الأحداث (الرباحية أنوبيس) ، وتميز منهم في الثقافة (2D) ثنائي الأبعاد قبل الركض والبذر كما هو موضح سابقا 9.
- توسيع SMCs باستخدام 131 MCDB المتوسطة (Mediatech ، هيرندون ، فرجينيا) مع 10 ٪ مصل بقري جنيني (Lonza ، Walkersville ، MD) ، 1 ٪ L - الجلوتامين (Mediatech) ، 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك (فيشر العلمية ، ديكورات المعرض ، نيوجيرسي) ، وإيجاد حل للمضادات الحيوية مضاد فطري (10000 وحدة دولية / مل البنسلين ، 10000 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، و 25 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين B ؛ Mediatech).
- فصل كل دائرة من الدوائر مفاعل حيوي تتدفق في مفاعل حيوي. SMCs البذور (مرور 4-6) على سقالة مع كثافة الخلايا 2x10 6 / 2 سم عن طريق حقن تعليق مع حقنة 5 مل في تجويف السقالات بعد قطع كلا مجافي اللمعة (مدخل) والتدفقات اللمعية (مخرج).
- تطرح جميع الغرف مفاعل حيوي في حاضنة التهجين عند 37 درجة مئوية ، وتناوب عليها في 2 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات للسماح للخلايا بحيث ينتشر بانتظام الى منصة الاعدام.
- تأخذ بها غرف مفاعل حيوي من التهجين حاضنة أعد لهم بالتدفق دائرة من مفاعل حيوي في غطاء محرك السيارة. نقل عن نظام مفاعل حيوي في الخلية الثقافة الحاضنة.
- توصيل أنابيب ضخ (القطر الداخلي = 1.6 ملم) إلى غضروف مضخة تمعجية وتحميل الطازجة المتوسطة الثقافة في الخزان. بدء نضح من خلال الجدار (اللمعية إلى مجافي اللمعة) في 1.0 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة تليها تدفق اللمعية فقط.
- زيادة معدل التدفق والضغط تدريجيا من 1.0 مل / دقيقة (إجهاد القص اللمعية : 1.1 dynes / سم 2) و 20 مم زئبق في اليوم 1-14،2 مل / دقيقة (15.3 dynes / سم 2) و 120 ملم زئبقي في يوم 21 ، على التوالي. تغيير أنابيب ضخ (القطر الداخلي = 3.2 ملم) في اليوم (4) والمتوسط مرة كل أسبوع.
4. حصاد الأنسجة وإعداد العينات للتحليل
- ثقافة بعد 21 يوما ، ووقف ضخ وشبكة أنابيب المشبك (مدخل ومخرج) من الخزان المتوسط. فصل أنابيب لضخ من غضروف مضخة تمعجية ونقل نظام مفاعل حيوي في غطاء محرك السيارة.
- المشبك مدخل ومخرج الأنابيب كل غرفة مفاعل حيوي وسلخه عن حلقة التدفق. فتح مدخل أنابيب وإعداد طبق بتري في أنابيب منفذا لجمع مستنبت داخل أنبوب البولي. فتح منفذ أنابيب ببطء وإزالة متوسطة من الغرفة.
- فصل مجافي اللمعة إبرة قياس اللمعية وأنابيب السيليكون من غرفة وفصل صفائح الألومنيوم عن طريق الإفراج عن المسامير الإبهام. إزالة أنبوب البولي وفصل واحدة من نهاية بناء الأنسجة من أنابيب PTFE.
- إعداد طبق بتري مليئة 10 مل من برنامج تلفزيوني وفصل الطرف الآخر من بناء الأنبوب من PTFE. وضعت بناء في برنامج تلفزيوني وشطف ثلاث مرات.
- قطع بناء بشفرة الحلاقة كما ملم بطول 5. تجميده عند -80 درجة مئوية الفريزر لمقايسة البيوكيميائية أو نقلها إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي مليئة 5 مل من متوسطة جديدة لاختبار ميكانيكية أو تجميد المفاجئة في الأنسجة تيك درجة الحرارة المثلى مجمع القطع (ساكورا Finetek شركة ، تورانس ، كاليفورنيا ) لالأنسجة / immunofluorescence تلطيخ.
5. ممثل النتائج :
كانت ملفقة أنبوبي السقالات PGS الاستومر القابلة للتحلل من قبل باستخدام أسلوب الانصهار الملح (الشكل 1A). كل غرفة توفر سقالات مفاعل حيوي مع كل من التدفقات اللمعية ومجافي اللمعة ، ويمكن فصل كوحدة منفصلة عن حلقة التدفق الرئيسي (الشكل 1B). وقد تم تصميم مفاعل حيوي لنظام السقالات four زراعة في وقت من خلال التحكم ومراقبة تدفق فضلا عن الضغط (الشكل 1C & D).
وقد تبين للثقافة التخطيطي مفاعل حيوي في الشكل. 2. بعد SMCs البذر ، وكان كل من المجلسين في مفاعل حيوي استدارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لتوزيع الخلايا بشكل موحد في لمعة من السقالة. ومن ثم ، تم تطبيق تدفق نابض لالسقالات حتى اليوم 14 مع معدل التدفق المتزايد تدريجيا (الشكل 2A) وضغط (الشكل 2B). بعد 14 يوما ، أبقى تدفق وضغط مستمر حتى نهاية عام الثقافة (يوم 21).
تم فحص مورفولوجيا سطح سقالة PGS بواسطة المجهر الإلكتروني (SEM). وأظهر المسح أن micrographs الإلكترون سقالة كان سمك الجدار متسقة (539 ± 18 ميكرون) (الشكل 3A) وتوزيعها عشوائيا الكلي والجزئي المسام على سطح اللمعية (الشكل 3B). وقد تم قياس المعلمات Morphometric من سقالة من التصوير المقطعي microcomputed (الدقيقة CT) التصوير والتحليل. متوسط حجم المسام هو 23.3 ± 3.9 ميكرومتر والترابط المسام هو 99.4 ± 0.62 ٪ ، مما يعني أن مترابطة تماما عن سقالة في المسام. المسامية التي تقاس التشريد الإيثانول 75.6 ± 2.7 ٪.
تم فحص مورفولوجيا الخلوية للبناء من قبل PGS SEM (الشكل 4). SMCs متعدد الطبقات السطحية مغطاة بالكامل اللمعية وكانت موجهة بشكل عمودي على اتجاه التدفق. هذه النتائج تظهر أن تكييف الميكانيكية من مفاعل حيوي تدفق نابض يدعم التوجه SMC في السقالة.
تم فحص وجود المصفوفة خارج الخلية (ECM) والألياف المرنة التي كتبها H & E تلطيخ والإيلاستين تألق ذاتي (الشكل 5). H & E تلطيخ أظهرت أن الخلايا والبروتينات ECM مغطاة بالكامل لمعة من PGS بناء. الإيلاستين تألق ذاتي كما أظهرت الألياف المرنة circumferentially نظمت على سطح اللمعية من بناء. تم قياس انتاج البروتينات ECM في بنيات PGS من المقايسات البيوكيميائية. كانت غير قابلة للذوبان والإيلاستين محتويات الكولاجين 20.2 ± 9.1 ميكروغرام / ملغ من الأنسجة و 6.3 ± 1.9 ميكروغرام / ملغ من الأنسجة ، على التوالي.
الشكل 1. سقالة تلفيق ونظام مفاعل حيوي. (أ) رسم تخطيطي للسقالة أنبوبية تلفيق. (ب) تفاعلات الاحيائية الغرفة. وتم ربط السقالات لأنابيب PTFE ، وضعت في أنبوب البولي ، والثابتة التي سدادات المطاط سيليكون وألواح سبائك الألومنيوم. كل غرفة ومسارات تدفق هما : التدفقات اللمعية (عن طريق أنابيب السيليكون) ومجافي اللمعة (بواسطة إبرة قياس). (C) نظام تفاعلات الاحيائية وضعت داخل الحاضنة. وهو يشمل خزان المتوسط ، تحوي وحدة ضخ ، مبادل الغاز ، محولات الضغط ، واثنين من الفتحات (العلوي والسفلي) ، وصمام إبرة. (د) وضع نظام تفاعلات الاحيائية خارج الحاضنة. وهي تشمل مراقبة ضغط ، وتدفق وحدة التحكم ، وبيانات نظام الاستحواذ ، والكمبيوتر.
الشكل 2. تخطيطي للثقافة مفاعل حيوي. (أ) بروتوكول الثقافة. (ب) التطبيقية ملامح ضغط في كل نقطة زمنية (يوم 1 و 4 و 7 و 14).
الشكل 3. مورفولوجيا سطح سقالة PGS. (أ) عبر الباب. (ب) التجويف.
الشكل 4. التشكل الخلوي لبناء PGS. (A) التجويف. (ب) المقطع العرضي للقطع 45 درجة. السهام في كل اتجاه الأرقام تمثل التدفق.
الشكل 5. الأنسجة والإيلاستين تألق ذاتي من PGS بناء. (أ) H & E تلطيخ. (ب) الموافق تألق ذاتي الإيلاستين. L : التجويف. التكبير : 40X. شريط الحجم : 50 ميكرون.
Discussion
تقنية التصنيع باستخدام الاستومر القابلة للتحلل وصفها هنا العديد من الميزات. (1) استخدمنا حمض الهيالورونيك (ها) في بيان العفن. منذ ها هو ذوبان في الماء ، أفرج عن سقالة بسهولة من العفن الزجاج بعد أن تمرغ في المياه. في هذا التقرير ، كنا 1.0 بالوزن / المجلد ٪ من حل HA بسبب تركيز منخفض (<0.5 بالوزن / المجلد ٪) من الحل وليس لزج يتدفق بسرعة عندما صب على رأس أنابيب زجاجية. إلى حل موحد HA معطف ، انقلبت لدينا أكثر من أنابيب الزجاج عندما حل طار أسفل الجزء السفلي من الأنابيب وكرر هذه الخطوة. هذا الطلاء ها هو إجراء حاسم لدينا تصنيع السقالات للإفراج النهائي. (2) استخدمنا الحرارة تقلص (HS) الأكمام للاحتفاظ الأملاح في أنابيب زجاجية. منذ الأملاح والمزدحمة بالسكان في المساحة الواقعة بين الجدار الداخلي للأنابيب الزجاج والأكمام HS ، احتفظ HS الأكمام بعد إزالة الأملاح مغزل وخاتم PTFE في الجزء السفلي من الأنابيب. يمكن أن نلغي HS الأكمام بسهولة عن طريق وضع القالب في الفرن على 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ومن ثم الحصول على قوالب الملح أنبوبي. (3) وقد استخدمنا أسلوب الانصهار الملح. ومن المعروف جيدا أن الملح يمكن أن تحسن أسلوب الانصهار الترابط المسام والخواص الميكانيكية طريق تنويع وقت الانصهار 10. علاوة على ذلك ، منذ كنا PGS ، فقد تم إنتاج الكلي المسام من جزيئات الملح خلال عملية الترشيح ، في حين يحتمل أن تكون المسام الصغيرة التي تشكلت خلال بخار الجلسرين PGS المعالجة كما وصفناها سابقا 11. وبالتالي ، فإن هذا الأسلوب لديه القدرة على افتعال السقالات الأنبوبية التي يسهل اختراقها مع الاقتصاد الكلي والجزئي مختلف هياكل متفاوتة بواسطة جزيئات الملح ، وكذلك علاج PGS الشرط.
قدمت تكييف الميكانيكية من مفاعل حيوي نابض نضح تدفق (الحد الأقصى يعني تدفق = 14 مل / دقيقة ، إجهاد القص أقصى = 15،3 داين / سم 2 ، والتردد = 0،5-1،7 هرتز) والضغط من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة مع سقالة PGS ، مما أدى إلى SMC النمو والتوجه (الشكل 4). هذه النتائج متسقة مع الدراسات السابقة التي تمتد التقارير الدورية في هذا التردد وإجهاد القص يزيد انتشار SMC 12 و 13،14 ECM إنتاج البروتين. بالإضافة إلى النمو SMC والتوجيه ، وبناء الدعم PGS ECM إنتاج البروتين ، وخصوصا تنظيم circumferentially الألياف المرنة (الشكل رقم 5) في غضون 3 أسابيع الثقافة في مفاعل حيوي. وقد أظهرت بعض الدراسات باستخدام سقالة بناء المرنة باعتبارها ذات القطر الصغير الشرايين وضغط القوة الميكانيكية انفجار مماثل في الشرايين الأصلية 15 ، والاندماج السريع في السقالات SMC متوافقة باستخدام الدوار قارورة 16،17 ، في حين لم يتم العثور على الألياف المرنة في هذه البنى. نتائجنا تشير الى ان انتفاخ دوري شعاعي من مفاعل حيوي تحسين ميكانيكية نقل الإشارة بصورة أكثر فعالية لSMCs في سقالة PGS ، والتي ساهمت على الأرجح إلى الإيلاستين التوليف والتنظيم.
منذ SMCs خلايا الأوعية الدموية هي الوحيدة المنتجة للبروتينات ECM في بطانة لدينا ، والنهج هادئة وتحسين القوة الميكانيكية اللازمة لتطوير ناجحة سريريا ذات القطر الصغير يبني الشرياني. وذكرت لنا أن الخلايا البطانية التعاون مع مثقف SMCs إنشاء المونولاير متكدسة وأيد بروتين تعبير النمط الظاهري في ظل ظروف ثقافتنا وتكييف الميكانيكية 9. لذا ، على أساس نهجنا وصفها هنا ، وتعديل شروط المشاركة في التجربة الثقافة ستكون الخطوة التالية لتحسين وظائف وتوليد التركيبات الناتجة nonthrombogenic ، قوية ، ومتوافقة مع الشرايين مماثلة لبناء الشرايين الأصلية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلف يشكر الدكتور جين قاو لتخليق PGS ، والدكتور بيتر Crapo للمناقشة متعمقة لإعداد مفاعل حيوي ، الدكاترة. محمد Ezzelarab ووو وى لقرد البابون explanting الشرايين السباتية. وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (R01 HL089658).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H7630 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| MCDB 131 | Mediatech, Inc. | 15-100-CV | |
| Fetal bovine serum | Lonza Inc. | BW14-502F | |
| L-glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CV | |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A62-500 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Mediatech, Inc. | 30-004-CI | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |
References
- The American Heart Association Statistics Committee Stroke Statistics Subcommittee. American Heart Association: Heart disease and stroke statistics-2009 update. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Isenberg, B. C., Williams, C., Tranquillo, R. T. Small-diameter artificial arteries engineered in vitro. Circ Res. 98, 25-35 (2006).
- Conte, M. S. The ideal small arterial substitute: a search for the Holy Grail. FASEB J. 12, 43-45 (1998).
- Wang, X., Lin, P., Yao, Q., Chen, C. Development of small-diameter vascular grafts. World J Surg. 31, 682-689 (2007).
- L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 12, 47-56 (1998).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. A tough biodegradable elastomer. Nat Biotechnol. 20, 602-606 (2002).
- Crapo, P. M., Gao, J., Wang, Y. Seamless tubular poly(glycerol sebacate) scaffolds: high-yield fabrication and potential applications. J Biomed Mater Res A. 86, 354-363 (2008).
- Gao, J., Ensley, A. E., Nerem, R. M., Wang, Y. Poly(glycerol sebacate) supports the proliferation and phenotypic protein expression of primary baboon vascular cells. J Biomed Mater Res A. 83, 1070-1075 (2007).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Gao, J., Crapo, P. M., Wang, Y. Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering. Tissue Eng. 12, 917-925 (2006).
- Wilson, E., Mai, Q., Sudhir, K., Weiss, R. H., Ives, H. E. Mechanical strain induces growth of vascular smooth muscle cells via autocrine action of PDGF. J Cell Biol. 123, 741-747 (1993).
- Leung, D. Y., Glagov, S., Mathews, M. B. Cyclic stretching stimulates synthesis of matrix components by arterial smooth muscle cells in vitro. Science. 191, 475-477 (1976).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Yang, J., Motlagh, D., Webb, A. R., Ameer, G. A. Novel biphasic elastomeric scaffold for small-diameter blood vessel tissue engineering. Tissue Eng. 11, 1876-1886 (2005).
- Stankus, J. J., Soletti, L., Fujimoto, K., Hong, Y., Vorp, D. A., Wagner, W. R. Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electrohydrodynamic atomization. Biomaterials. 28, 2738-2746 (2007).
- Nieponice, A., Soletti, L., Guan, J., Deasy, B. M., Huard, J., Wagner, W. R., Vorp, D. A. Development of a tissue-engineered vascular graft combining a biodegradable scaffold, muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique. Biomaterials. 29, 825-833 (2008).
