Summary
Quantitatives à haut débit, en temps réel, et sans étiquette de détection biomoléculaire (ADN, protéines, etc) sur SiO
Abstract
La mesure sensible des interactions biomoléculaires a une utilisation dans de nombreux domaines et secteurs tels que la biologie et la microbiologie de base, le suivi environnemental / agricole / biodéfense, la nanobiotechnologie, et plus encore. Pour les applications de diagnostic, de surveillance (détection) la présence, absence, ou une expression anormale de biomarqueurs protéomiques humaines ou des cibles génomiques trouvées dans les échantillons de patients peut être utilisée pour déterminer les approches de traitement ou de l'efficacité thérapeutique. Dans le domaine de la recherche, des informations sur des affinités et spécificités moléculaires sont utiles pour caractériser complètement les systèmes de l'enquête.
Bon nombre des systèmes actuels utilisés pour déterminer les concentrations moléculaires ou des affinités reposent sur l'utilisation d'étiquettes. Des exemples de ces systèmes comprennent immunoessais tels que le dosage immuno-enzymatique (ELISA), la réaction en chaîne polymérase (PCR), des dosages électrophorèse sur gel, et la spectrométrie de masse (MS). Généralement, ces étiquettes sont fluorescentes, radiologiques ou colorimétrique de la nature et sont attachés directement ou indirectement à la cible moléculaire de l'intérêt. Bien que l'utilisation d'étiquettes est largement acceptée et a quelques avantages, il ya des inconvénients qui sont la stimulation du développement de nouveaux sans étiquette méthodes pour mesurer ces interactions. Ces inconvénients sont multiples facettes pratiques telles que le coût accru de dosage, durée de vie de réactifs et des préoccupations convivialité, de stockage et de sécurité, les pertes de temps et d'efforts à l'étiquetage et la variabilité entre les différents réactifs en raison des processus d'étiquetage ou les étiquettes elles-mêmes. Sur une base de recherche scientifique, l'utilisation de ces étiquettes peuvent également introduire de telles difficultés en ce qui concerne les effets sur la fonctionnalité des protéines / structure en raison de la présence des étiquettes apposées et l'impossibilité de mesurer directement les interactions en temps réel.
Présentée ici est l'utilisation d'un nouveau label sans biocapteur optique qu'il se prête à des études de microréseaux, appelé capteur de réflexion interférométrique Imaging (IRIS), pour détecter les protéines, l'ADN, le matériel antigénique, les agents pathogènes entiers (virions) et autre matériel biologique. Le système IRIS a été démontré que la sensibilité élevée, la précision et la reproductibilité des interactions biomoléculaires différentes [1-3]. Les avantages comprennent la capacité d'imagerie multiplexe, en temps réel et des capacités de mesure d'extrémité, et d'autres haut-débit des attributs tels que la consommation de réactifs réduites et une réduction du temps de dosage. En outre, la plateforme IRIS est simple à utiliser, nécessite un matériel peu coûteux, et utilise à base de silicium massif composants de l'essai de phase rend compatible avec de nombreuses approches contemporaines chimie de surface.
Ici, nous présentons l'utilisation du système IRIS de la préparation des réseaux de sondes à l'incubation et la mesure des cibles contraignantes pour l'analyse des résultats dans un format point final. Le système modèle sera la capture d'anticorps cibles qui sont spécifiques pour l'albumine sérique humaine (HSA) sur HSA repéré substrats.
Protocol
1. Préparation du support
- Manteau couches de silicium SiO 2 substrats avec l'auto-adsorbant copoly (DMA-NAS-MAPS):
- Synthèse de copolymère, la structure chimique et procédé de revêtement sont publiés dans: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caractérisation d'un revêtement polymérique adsorbées des diapositives ADN Microarray de verre. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358.
- En bref, préparer la solution de polymère par ajout de 100 mg de polymère à 5 mL d'eau désionisée (DI) d'eau et ajoutez 5 ml de sulfate d'ammonium saturé à 40% ((NH 4) 2SO 4) solution pour atteindre une concentration finale de 0,92 M.
- Plonger dans une solution de puces pendant 30 min sur un agitateur, puis rincer abondamment à l'eau DI. Séchez soigneusement à l'Argon / gaz N 2.
- Cuire les puces à 80 ° C pendant 15 min.
- Boutique revêtu de polymère substrats / chips dans un environnement sec (dessiccateur à vide) pour un maximum de 3 mois jusqu'à la sonde spotting procédure.
2. Préparation du réseau de sondes: anticorps, des antigènes, ss / dsADN, ARN, etc
- Diluer la sonde (s) à la concentration appropriée dans le tampon désiré. Cette étape peut être varier considérablement, mais une expérience typique utilise un antigène ou d'IgG à une concentration de 0,5 mg / mL (plage de 0,1 -1 mg / ml) en tampon phosphate salin (PBS) à pH ≈ 7,4.
- Placer les solutions dans un 96 - ou 384 puits (ou de la plaque source standard pour l'observateur est utilisé)
- Configuration des paramètres pour repérer array imprimées souhaité: déterminer les paramètres appropriés de repérage pour la surface et des solutions utilisées (temps de séjour, les vitesses d'approche, etc.) Déterminer le nombre de répétitions de chaque condition par grille, la disposition en grille, le nombre de grilles de reproduire, et l'emplacement désiré taches sur la puce. Placer la plaque et de substrats source dans les endroits appropriés, vérifiez bouteilles déchets et l'approvisionnement sont prêts, et de commencer à lancer l'impression.
- Après avoir repéré est terminé substrats lieu dans un environnement très humide durant la nuit (4-18 heures) pour permettre processus d'immobilisation et la désactivation de procéder.
- Lavez substrats: les placer dans les solutions suivantes pour trois minutes pour trois lavages distincts: PBS avec 0,1% de Tween (PBST), PBS, et enfin déminéralisée (DI) de l'eau. Selon le type d'expérience (humide vs sec), la puce sèche soigneusement avec du gaz argon et de commencer l'incubation ou de placer la puce dans une chambre d'écoulement et à assembler.
- Désactiver autres groupes du NHS sur la surface de copolymère en submergeant les puces dans une solution de 50 mM d'éthanolamine avec le pH ajusté à 7,4 pendant 30 minutes tandis que sur une plaque shaker. Un premier composé aminé tels que l'hydroxylamine ou Tris peut également être utilisé, tant la solution préparée est sûr à utiliser avec des protéines. Rincer soigneusement la solution en utilisant la désactivation du PBS, puis de l'eau déminéralisée.
- Étape facultative (en fonction de la chimie de surface étant employé): surface du bloc en utilisant une solution de BSA, caséine, ou de lait réhydraté pendant 30 minutes. Pour la chimie de surface polymérique actuelles que nous utilisons, nous ne sommes pas effectuer cette étape que le squelette du polymère agit pour empêcher la protéine de liaison non-spécifique.
3. Acquisition de données et d'incubation de procédure: le format Endpoint
- Faire une solution de la cible d'intérêt dans le tampon désiré. Ici, ce sera une solution de la concentration appropriée de l'anti-BSA dans du PBS (ex: faire ml 1-10 de 10 ng une / ml, solution d'anti-BSA en PBS). Aussi, assurez-vous d'avoir une quantité équivalente de tampon (sans cible) pour l'incubation de contrôle négatif.
- Prenez un miroir de balayage de silicium pour normaliser toutes les données recueillies par la suite.
- Analyser le réseau de sondes préparées avec le système IRIS avant l'étape d'incubation pour déterminer la hauteur initiale optique (de masse) à chaque endroit. Cela permettra une analyse correcte des variations de la masse à la surface, c'est à dire le niveau de la liaison, après l'incubation. Ici, quelques paramètres seront ajustés pour l'expérience actuelle, comme le temps d'exposition, champ de vision, en se concentrant prospèrent, etc
- Immergez puce (s) dans la solution préparée pendant 1 heure sur une plaque shaker. Le temps d'incubation peut varier considérablement selon le niveau d'agitation, la concentration de la cible étant détectée, les caractéristiques de transport de la chambre de circulation (si un mode de détection en temps réel est utilisée), les affinités de la paire cible-sonde, etc .
- Après l'incubation, répéter la procédure de lavage décrite à l'étape 2.5)
- Balayage du tableau même sonde en utilisant le système IRIS et d'obtenir des images post-incubation pour la pré-incubation de comparaison.
- Répétez ce processus pour différentes étapes d'incubation, si nécessaire, par exemple dans un format de dosage sandwich où un anticorps secondaire est utilisé.
4. Analyse des données
- Monter les images recueillies pour chaque balayage de l'iris (séquence d'images d'intensité), en utilisant le logiciel développé pour laboratoire Produire une image de la matrice de la sonde contenant des informations épaisseur optique. Une rapide analyse qualitative de liaison peut être effectuée en soustrayant (enregistrée) post-et pré-incubation des images. Reliure apparaîtra comme un changement dans l'intensité à ces endroits où les changements de masse ont été observées. Pour l'analyse quantitative, déterminer la densité de masse de chaque spot par rapport à l'arrière-plan en faisant la moyenne des informations épaisseur optique pour chaque pixel dans un endroit et une couronne de l'extérieur de l'endroit et de faire une comparaison directe de ces deux domaines.
5. Les résultats représentatifs:
La figure 1 montre un schéma de l'exemple de couches Si-SiO 2 substrat IRIS repéré avec une gamme d'anticorps représentant. Chaque ensemble d'anticorps est repéré dans répliquer avec une spécificité pour un épitope différent ciblant différentes protéines. Deux différents virus entier et une protéine virale sont représentés comme des cibles par exemple. Anticorps de contrôle négatif dépend du dosage et peut être non spécifiques et / ou spécifiques du virus.
La figure 2 montre la liaison de l'albumine sérique humaine (HSA) des anticorps spécifiques à un tableau d'repéré HSA et IgG de lapin (contrôle) des taches. Comme vu ici, après le montage et la détermination des épaisseurs optiques pour les images pré-et post-incubation, une image de différence pour le tableau de liaison peut être créée pour évaluer qualitativement contraignant. L'analyse quantitative révèle que 2,05 et 0,13 nanomètre modification moyenne hauteur optique a été observée pour le HSA et le lapin taches IgG, respectivement, pour une concentration d'incubation anti-SAH de 500 ng / mL.
La figure 3 montre une mesure de la dépendance en protéines IRIS fourrure contraignant sur la concentration de protéines et de la longueur d'oligomères ADN double brin. Le graphique supérieur montre les mesures de hauteur absolue optique pour initiales immobilisé hauteurs de sonde oligomère et contraignant fourrure post-incubation. Des concentrations croissantes de la fourrure (50, 100, 200 nM) a entraîné liaison accrue aux sondes ADN. La longueur des oligomères impacts lie également la fourrure avec des séquences plus longues résultant en plus contraignantes. Ici, les barres d'erreur représentent un écart-type de la moyenne. L'intrigue du bas montre calculée dimère protéique fourrure contraignante par brin ADN double brin. Dimer liaison était significativement plus élevée à une concentration protéique de la fourrure du 200 nM suggérant un haut niveau de la liaison non spécifique.
Figure 1. Schéma d'un tableau par exemple la sonde normalement utilisés dans une expérience pour détecter les virus et composants spécifiques d'une manière virale multiplexées avec le système IRIS.
Figure 2. Image de différence post-incubation de liaison de l'albumine sérique humaine des anticorps spécifiques aux repéré HSA recueillies grâce à ce système sans étiquette, à une concentration de 500 ng / mL. La masse volumique biomatériau pour chaque spot est déterminée par la moyenne informations épaisseur optique dans un endroit et puis en comparant cela avec la moyenne d'un anneau autour de la tache représentant le fond.
Figure 3. Parcelle de liaison de données pour les interactions entre protéines Fur avec repéré double brin oligomères avec une séquence consensus connue basée sur la longueur oligomère, l'emplacement de la séquence consensus au sein de l'oligomère et la concentration de protéines Fur. Informations sur le montant absolu de la protéine Fur liée à chaque séquence repérée (en haut) peuvent être utilisés pour estimer le nombre de dimères fourrure liés à chaque type d'oligomère (en bas).
Discussion
La plateforme IRIS est un système simple et rapide à utiliser pour la collecte à haut débit de liaison de données dans un format de biopuces. En immobilisant covalente différentes sondes fonctionnelles des protéines ou d'ADN sur une surface, les antigènes cibles / biomarqueurs / etc. peuvent être capturés de la solution, comme dans un dosage immunologique. La mesure de ces interactions entre les conditions de sonde dans un terminal ou en temps réel de format avec le système IRIS permet d'informations hautement sensibles et quantitatives à recueillir pour chaque interaction. L'expérience représentative détaillé ici est juste un exemple des types d'interactions qui peuvent être étudiés avec cette technique. La détection des facteurs de transcription, des antigènes viraux, et les virus tout entier a été démontré précédemment, et ne représente que quelques exemples des types d'analyses que l'iris peut facilement manipuler.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Technologies Inc Zoiray, un partenaire co-sponsor et la commercialisation, pour son soutien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
- Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
