Summary
그런가에 대한 정량, 높은 처리량, 실시간 및 레이블이없는 biomolecular 감지 (DNA, 단백질 등)
Abstract
biomolecular 상호 작용의 민감한 측정은 기본적인 생물학, 미생물학, 환경 / 농업 / biodefense 모니터링, nanobiotechnology, 그리고 더 많은 분야와 산업에 사용하고 있습니다. 진단 어플 리케이션을 위해, 모니터링 (감지)의 존재, 부재, 또는 환자 샘플에서 발견된 대상 proteomic 또는 게놈 생체 비정상적인 표현은 치료 접근 또는 치료 효능을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 연구 분야에서 분자 동질성 및 specificities에 대한 정보를 충분히 조사를 받고 시스템을 특성화하는 데 유용합니다.
분자 농도 또는 동질성을 확인하는 고용은 현재 시스템의 대부분은 라벨의 사용에 의존하고 있습니다. 이러한 시스템의 예로는에는 효소 연결된 면역 분석 (엘리사), 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR) 기법, 겔 전기 영동의 assays, 그리고 질량 분석계 (MS)로 immunoassays을 포함합니다. 일반적으로,이 라벨, 형광 방사선, 또는 자연 colorimetric하고 직접 또는 간접적으로 관심의 대상 분자에 붙어있다. 레이블의 사용이 널리 인정 및 일부 혜택을 가지고있다지만, 이러한 상호 작용을 측정하는 새로운 레이블없는 방법의 개발을 자극하는 단점이있다. 이러한 단점은 증가 분석 비용, 시약 수명과 유용성, 스토리지 및 안전 문제 등 실용적인 면을, 라벨의 낭비 시간과 노력, 그리고 라벨 프로세스 또는 라벨 자체로 인해 다른 시약 간의 다양성을 포함합니다. 과학 연구 기초에서 이들 레이블의 사용은 또한 단백질 기능 / 첨부 라벨과 직접 실시간으로 상호 작용을 측정하는 무능력의 존재로 인해 구조에 미치는 영향과 문제로 어려움을 도입할 수 있습니다.
여기서 제시하는 연구를 microarray 의무가있는 새 레이블이없는 광학 바이오 센서의 사용은, Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)는 감지 단백질, DNA, antigenic 자료 전체 병원균 (virions) 및 기타 생물 학적 재료, 칭했다. IRIS 시스템은 다른 biomolecular 상호 작용 [1-3]에 대한 높은 감도, 정밀도 및 재현성을 가지고 증명되었습니다. 장점 멀티 플렉스 이미징 용량, 실시간 엔드 측정 기능 및 감소 시약 소비와 분석 시간의 감소와 같은 다른 높은 처리량 속성을 포함합니다. 또한, IRIS 플랫폼은 사용이 간단 저렴한 장비를 필요로하고, 많은 현대 표면 화학 방식과 호환하는 실리콘 기반의 견고한 위상 분석 구성 요소를 사용합니다.
여기, 우리는 프로브 배열의 준비에서 부화 및 끝점 형식으로 결과를 분석 바인딩 대상의 측정에 IRIS 시스템의 사용을 제시한다. 모델 시스템은 HSA - 반해 기판에 (HSA) 인간 혈청 알부민에 대한 구체적인 대상 항체의 캡처됩니다.
Protocol
1. 기판 준비
- 외투 계층 실리콘 그런가 자기 adsorbing copoly (DMA - NAS - MAPS) 2 기판 :
- 공중 합체의 합성, 화학 구조, 및 코팅 과정으로 게시됩니다 : G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero합니다. DNA Microarray 유리 슬라이드에 고분자 Adsorbed 코팅의 특성. 항문. 화학. 2004, 76, 1352년에서 1358년까지.
- 간단히, deionized (DI) 물 5 ML하는 폴리머의 100 밀리그램을 추가하여 폴리머 솔루션을 준비하고 0.92 M.의 최종 농도에 도달 40 % 포화 암모늄 황산 ((NH 4) 2SO 4) 솔루션의 5 ML을 추가
- 흔드는 30 분 용액에 그리고 잠수함 칩 디 물로 깨끗이 씻어. 아르곤 / N 2 가스로 완전히 건조.
- 80 베이크 칩 ° C 15 분.
- 스토어 폴리머 코팅 최대 3 개월 동안 건조 환경 (진공 건조기)에 기판 / 칩 탐사선이 절차를 야생까지.
2. 항체, 항원, SS / dsDNA, RNA 등 : 프로브 배열의 준비
- 원하는 버퍼에 적절한 농도 프로브 (S)을 희석. 이 단계는 상당히 다를 수 있지만, 전형적인 실험 산도 ≈ 7.4에서 호수 (PBS)를 버퍼 인산의 0.5 MG / ML의 농도 (0.1 -1 MG / ML 범위)에 항원 또는 IgG을 활용합니다.
- 이곳은 96 솔루션 - 또는 384 - 글쎄 플레이트 (또는 반점을 찍는 사용을위한 표준 소스 판)
- 원하는 인쇄 배열 매개 변수를 야생 설정 (시간, 접근 속도 등 머물러) 사용되는 표면 및 솔루션에 적합한 야생 매개 변수를 결정합니다. 그리드, 그리드 레이아웃, 복제 그리드의 번호 및 칩 원하는 야생 위치마다 각각의 조건의 복제의 수를 결정합니다. 플레이스 기판과 적절한 위치에 소스 판은 물론 폐기물 및 공급 병 준비 확인 및 인쇄 실행을 시작합니다.
- 관찰은 고정 및 해제 과정이 계속 수 있도록 (4~18시간) 높은 습도 환경에서 장소 기판은 밤새 완료되면.
- 와시 기판 : 0.1 % 트윈 (PBST), PBS, 그리고 마지막으로 deionized (DI) 물을 PBS 세 별도의 세척을위한 3 분 다음과 같은 솔루션에서 그들을 놓으십시오. 실험의 종류에 따라 (서부 유럽 표준시 대 건조), 아르곤 가스로 철저하게 칩을 건조하고 부화를 시작하거나 흐름 챔버에 칩을 넣고 조립.
- 쉐이크 접시에있는 동안 30 분 동안 7.4로 조정 산도와 ethanolamine 50 MM 솔루션의 칩 잠수함이 잠수하여 공중 합체의 표면에 남아있는 NHS 그룹을 비활성화합니다. 이러한 히드록 실 아민 또는 트리스와 같은 기본 아민 함유 화합물은 또한 오랫동안 준비된 솔루션은 단백질과 함께 사용하는 것이 안전으로 사용할 수 있습니다. 철저히 PBS 다음 DI 워터를 사용하여 해제 솔루션을 씻어.
- 선택 단계 (고용되는 표면 화학에 따라 다름) : BSA, 카제인의 용액 또는 30 분 rehydrated 우유를 사용하여 블록 표면. 폴리머 백본이 아닌 특정 단백질 바인딩을 방지하기 위해 행위로 우리가 사용하는 현재의 고분자 표면 화학에 대한, 우리는이 단계를 수행하지 마십시오.
3. 데이터 수집과 부화 절차 : 종점 형식
- 원하는 버퍼에 대한 관심의 대상의 솔루션을 확인하십시오. 여기, 그것은 PBS에 방지 BSA의 적절한 농도 (10 NG / PBS에 방지 BSA의 ML 솔루션 중 1-10 ML을 예)의 솔루션이 될 것입니다. 또한, 대조군 보육에 대한 버퍼의 상당 금액을 (대상 제외)해야 있는지 확인합니다.
- 모두 이후에 수집된 데이터를 정규화를위한 실리콘 미러 검사를 가져가라.
- 각 명소의 초기 광학 높이 (질량)을 결정하기 전에 인큐베이션 단계로 IRIS 시스템으로 준비 프로브 배열을 검사합니다. 이것은 표면에 질량의 변화에 적절한 분석을 위해 수, 부화 후, 바인딩의 수준을 즉. 여기 몇 가지 매개 변수가 현재와 같은 노출 시간으로 실험, 시야, prospering 초점 등 조정됩니다
- 쉐이크 접시에 1 시간 동안 준비 용액에 잠수함 칩 (S). 배양 시간이 상당히 동요의 수준에 따라 달라질 수, 대상의 농도가 감지되고, 흐름 챔버의 전송 특성 (실시간 감지 모드를 사용중인 경우), 대상 - 프로브 쌍 동질성이 등 .
- 부화 후) 2.5 단계에서 설명한 세척 절차를 반복
- IRIS 시스템을 사용하여 동일한 프로브 어레이를 스캔 및 사전 부화 비교 후 부화 이미지를 구하십시오.
- 보조 항체가 사용되고 샌드위치 분석 형식으로 예를 들어, 필요한 경우 다른 부화 단계에 대해이 과정을 반복합니다.
4. 데이터 분석
- 프로 연구실 개발한 소프트웨어를 사용, 각 IRIS 스캔 (강도 이미지 시퀀스)에 대한 수집된 이미지 맞추기광학 두께 정보를 포함하는 프로브 어레이의 이미지를 듀스. 바인딩의 빠른 정성 분석 (등록) 게시 및 사전 부화 이미지를 빼서하여 수행할 수 있습니다. 바인딩 대량의 변경이 관찰되었다 반점에서 강도의 변화로 나타납니다. 정량 분석을 위해, 현장의 현장과 환대 밖 내의 각 픽셀에 대한 광학 두께 정보를 평균하고이 두 분야의 직접 비교하여 배경에 비해 각 지점의 질량 밀도를 결정한다.
5. 대표 결과 :
그림 1은 대표적인 항체 배열로 발견 계층시 - 그런가 2 IRIS 기판의 예제 설계도를 보여줍니다. 각 항체 앙상블은 다른 단백질을 대상으로 다른 에피토프에 대한 특이성과 복제에서 발견됩니다. 두 개의 다른 모든 바이러스 및 바이러스 단백질은 예를 대상으로 표시됩니다. 대조군 항체는 분석에 따라이 아닌 특정 및 / 또는 바이러스 특정 수 있습니다.
그림 2는 (HSA) 인간 혈청 알부민의 바인딩을 보여줍니다 특정 발견 HSA와 토끼 IgG (제어) 명소의 배열에 항체. 여기로 본, 광학의 조립과 결정 후 사전 및 사후 부화 이미지 두께, 바인딩 배열의 차이 이미지는 질적으로 평가하기 위해 바인딩을 만들 수 있습니다. 정량 분석은 2.05와 0.13 나노미터는 광학 높이 변경 500 NG / ML의 방지 HSA 부화 농도에 대한 각각의 HSA와 토끼 IgG 명소에 대한 관찰 있었다는 것을 보여줍니다.
그림 3은 단백질 농도 및 dsDNA의 올리고머의 길이에 모피 단백질 바인딩 의존의 IRIS 측정을 보여줍니다. 상단 그래프는 초기 고정 올리고머 프로브 헤이츠 및 사후 배양 펄 바인딩에 대한 절대 광학 높이 측정을 보여줍니다. 모피의 증가 농도 (50, 100, 200 NM)은 DNA 프로브로 증가 바인딩 결과. oligomers의 길이도 더 바인딩의 결과로 더 이상 시퀀스와 펄 바인딩을 영향을 미칩니다. 여기, 오차 막대는 뜻에서 한 표준 편차를 나타냅니다. 하단 줄거리는 dsDNA 스트랜드 당 바인딩 계산 펄 단백질 이합체를 보여줍니다. 이합체 구속력이 크게되지 않은 특정 바인딩의 높은 수준을 제안 200 NM의 모피 단백질 농도에서 증가했다.
그림 1. 일반적으로 IRIS 시스템을 갖춘 멀티 플렉스 방식으로 특정 바이러스 및 바이러스 구성 요소를 감지하는 실험에 사용되는 예제 프로브 배열의 도식.
그림 2. 목격 HSA에 인간 혈청 알부민 특정 항체의 바인딩을위한 포스트 인큐베이션 차이 이미지 500 NG / ML의 농도에서이 레이블이없는 시스템을 수집했습니다. 각 장소에 대한 biomaterial 질량 밀도가 자리 이내 광학 두께 정보를 평균하고 배경을 나타내는 지점 주위에 고리의 평균이 비교에 의해 결정됩니다.
그림 3. 올리고머의 길이, 올리고머 이내에 합의 순서의 위치, 그리고 펄 단백질 농도를 기반으로 알려진 합의 순서와 발견 더블 좌초 oligomers로 펄 단백질 상호 작용에 대한 데이터 바인딩의 플롯. 각 발견 순서 (상단)에 바운드 모피 단백질의 절대 금액에 대한 정보는 올리고머 (하단)의 각 유형에 바운드 모피 dimers의 수를 추정하는 데 사용할 수 있습니다.
Discussion
IRIS 플랫폼 microarray 형식으로 높은 처리량 데이터 바인딩을 수집하기 위해 사용하는 간단하고 신속한 시스템입니다. covalently 표면에 다른 기능 단백질이나 DNA 프로브를 immobilizing하여 대상 항원 / 생체은 / etc. 면역 분석법에서와 같이, 솔루션에서 캡쳐한 수 있습니다. IRIS 시스템 끝점 또는 실시간 형식으로 프로브 조건에 걸쳐 이러한 상호 작용의 측정은 각 상호 작용에 대해 수집하는 매우 민감하고 정량적 정보를 얻을 수 있습니다. 여기에 자세한 대표적인 실험들이이 기술에 대해 공부 할 수있는 상호 작용의 유형 중 한 예입니다. 전사 요인, 바이러스성 항원 및 전체 바이러스의 감지는 이전에 다음 ID로 시연과 IRIS 쉽게 처리할 수있는 분석의 유형의 몇 가지 사례를 나타냅니다되었습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 지원 Zoiray 기술 주식 회사, 공동 스폰서와 상용화 파트너를, 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
- Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
