Summary
Количественный, высокой пропускной способности в режиме реального времени и без наклеек обнаружения биомолекул (ДНК, белки и др.) на SiO
Protocol
1. Подготовка основания
- Пальто слоистых кремния SiO 2 субстратов с само-адсорбирующих сополимеры (DMA-NAS-MAPS):
- Сополимер синтеза, химической структуре, и процесс покрытия опубликованы в: Г. Pirri, Ф. Дамин, М. Киари, Е. Bontempi, Л. Деперо. Характеристика полимерных покрытий для адсорбированных Слайды ДНК-микрочипов стекла. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-58.
- Короче говоря, готовить раствор полимера, добавив 100 мг полимера до 5 мл деионизированной (DI) воду и добавьте 5 мл 40% насыщенного сульфата аммония ((NH 4) 2SO 4) решение для достижения конечной концентрации 0,92 М.
- Погрузите чипов в растворе в течение 30 минут на шейкере, а затем тщательно промыть водой DI. Сухой тщательно Аргон / N 2 газа.
- Выпекать чипов при 80 ° С в течение 15 мин.
- Магазин с полимерным покрытием подложки / фишки в сухой среде (вакуум эксикаторе) на срок до 3 месяцев, пока зонд кровянистые выделения процедуры.
2. Подготовка зонда Array: антитела, антигены, сс / двухцепочечной ДНК, РНК и т.д.
- Развести зонд (ы) в соответствующие концентрации в нужном буфере. Этот шаг может быть значительно различаются, но типичном эксперименте используется антиген или IgG в концентрации 0,5 мг / мл (диапазон от 0,1 -1 мг / мл) в фосфатном буферном растворе (PBS) при рН ≈ 7,4.
- Место решения в 96 - или 384-луночного планшета (или стандартного пластины источника корректировщик используется)
- Установка кровянистые выделения параметры желаемого печатного массива: определить соответствующие кровянистые выделения параметров поверхности и решений используется (продолжительность, скорость приближения и т.д.). Определить количество повторов каждого условия в сетку, сетку макета, число повторить сетки и желаемой кровянистые выделения места на чипе. Место подложки и источника пластины в соответствующих местах, проверить, чтобы убедиться, бутылки отходов и предложения готовы, и начать печать перспективе.
- После завершения кровянистые выделения места субстратов в условиях высокой влажности ночь (4-18 часов), чтобы позволить иммобилизации и процесс дезактивации для продолжения.
- Вымойте основания: поместите их в следующие решения в течение трех минут для трех отдельных моет: PBS с 0,1% Tween (PBST), PBS, и, наконец, деионизированной (DI) воде. В зависимости от типа эксперимента (мокрый по сравнению с сухими), сухой чип полностью с газом аргоном и начать инкубации или место чип в проточную камеру и собрать.
- Отключите остальные NHS групп на поверхности сополимера, погружая чипов в 50 мМ раствора этаноламина с рН до 7,4 в течение 30 минут, пока на тарелке шейкер. Первичный амин-содержащего соединения, такие как гидроксиламин или Трис также могут быть использованы до тех пор, приготовленный раствор можно безопасно использовать с белками. Тщательно промойте дезактивации решения с использованием PBS то DI воды.
- Дополнительный шаг (в зависимости от химического состава поверхностных получить работу): Блок поверхности с помощью раствора BSA, казеин, молоко или регидратации в течение 30 минут. Для текущего полимерной химии поверхности, которые мы используем, мы не выполнять этот шаг как цепи полимера актов для предотвращения неспецифического связывания с белками.
3. Устройства сбора данных и инкубации Процедура: Endpoint формате
- Сделать решения целевой интерес в нужном буфере. Вот, это будет решением соответствующей концентрации анти-BSA в PBS (например: сделать 1-10 мл 10 нг / мл раствора по борьбе с BSA в PBS). Кроме того, убедитесь, что эквивалентное количество буфера (без цели) для отрицательного контроля инкубации.
- Возьмите сканирования кремния зеркало для нормализации всех Впоследствии собранные данные.
- Сканирование подготовлены массив зонд с системой IRIS до инкубации для определения начальной оптической высоте (массы) на каждом месте. Это позволит обеспечить надлежащий анализ изменений в массу на поверхность, т. е. уровень связывания после инкубации. Здесь несколько параметров будут скорректированы для текущего эксперимента, таких как время экспозиции, поле зрения, процветающей фокусировки, и т.д.
- Погрузите чип (ы) в приготовленный раствор в течение 1 часа на тарелку шейкер. Инкубационный период может значительно изменяться в зависимости от уровня возбуждения, концентрации целевого обнаружения, транспортных характеристик проточную камеру (если в режиме реального времени обнаружения режиме используется), общность целевой зонда пару, и т.д. .
- После инкубации, повторите процедуру промывания, описанных в пункте 2.5)
- Сканирование одного массива зонда с помощью системы IRIS и получить после инкубации изображений для предварительной инкубации сравнения.
- Повторите этот процесс для различных этапов инкубации при необходимости, например, в формате сэндвич анализа, где вторичные антитела используются.
4. Анализ данных
- Fit собраны изображения для каждого IRIS сканирования (последовательность интенсивность изображения), с использованием лабораторного разработали программное обеспечение, чтобы проДуче образ зонд массив, содержащий информацию оптические толщины. Быстрый качественный анализ связывания могут быть выполнены путем вычитания (зарегистрированных) пост-и пре-инкубации изображений. Привязка будет выглядеть как изменение интенсивности в тех местах, где масса изменений не наблюдалось. Для количественного анализа, определения плотности массы каждое пятно по сравнению с фоном в результате усреднения оптической информации толщины для каждого пикселя в пределах пятна и кольца за пределами места и сделать прямое сравнение этих двух областях.
5. Представитель Результаты:
На рисунке 1 показан пример Схема слоистой Si-SiO 2 IRIS подложки пятнистый с представителем массив антител. Каждое антитело ансамбля замечены в репликацию с специфичность для различных эпитопа предназначенные для разных белков. Два разных целом вирусов и вирусных белков представлены в качестве примера целей. Отрицательный контроль антител зависит от анализа и может быть неспецифическим и / или конкретного вируса.
На рисунке 2 показан связывания сывороточного альбумина человека (HSA)-специфических антител к множество пятнистых HSA и кролика IgG (контроля) пятна. Как видно здесь, после установки и определение оптических толщин для пред-и пост-инкубации изображений, разница на изображение для обязательного Массив может быть создан с целью качественного анализа связывания. Количественный анализ показывает, что 2,05 и 0,13 нанометра средняя оптическая изменение высоты наблюдалась HSA и кролика IgG пятна, соответственно, для анти-HSA инкубации концентрации 500 нг / мл.
На рисунке 3 показана измерения IRIS меха связывания с белками зависимости от концентрации белка и двухцепочечной ДНК олигомеров длины. Верхний график показывает абсолютные оптические измерения высоты для первоначальной иммобилизованных олигомер датчик высоты и после инкубации меха обязательными. Повышение концентрации меха (50, 100, 200 нм) приводит к увеличению связывания с ДНК-зондов. Длина олигомеры также влияет на связывание с мехом длинных последовательностей в результате чего более обязательными. Здесь, погрешности представляют собой одно стандартное отклонение от среднего значения. Нижний график показывает, рассчитанные димера меха связывания с белками на каждый блок двухцепочечной ДНК. Димер обязательной была значительно увеличена при концентрации меха белка в 200 Нм, что свидетельствует о высоком уровне неспецифического связывания.
Рисунок 1. Схема пример массива зонд, обычно используемых в эксперименте для обнаружения специфических вирусов и вирусных компонентов в мультиплексированных моды с системой IRIS.
Рисунок 2. После инкубации разница изображение для связывания сывороточного альбумина человека-специфических антител к пятнистой HSA собранных с этим ярлыком, свободной системы в концентрации 500 нг / мл. Плотность биоматериала массы для каждого пятна определяется путем усреднения оптической информации толщина в месте, а затем сравнивая это с среднем кольце вокруг пятна представляют фоне.
Рисунок 3. Участок связывания данных для меха белковых взаимодействий с пятнистой двухцепочечной олигомеров с известными консенсусной последовательности на основе олигомер длина, расположение консенсусной последовательности в олигомер, и концентрация меха белка. Информация об абсолютной сумме меха белка связаны друг с последовательностью пятнистый (вверху) может быть использована для оценки числа меха димеры связаны друг с типом олигомер (внизу).
Discussion
Платформа IRIS является простая и быстрая система будет использоваться для сбора высокой пропускной привязки данных в формате микрочипов. По ковалентно иммобилизации различных функциональных проб белка или ДНК на поверхности, целевых антигенов / биомаркеров / и т.д.. могут быть захвачены из раствора, как и в иммуноанализа. Измерение этих взаимодействий между зондом условия в конечной точке или в режиме реального времени формата с системой IRIS позволяет очень чувствительны и количественной информации должны быть собраны для каждого взаимодействия. Представитель эксперимента подробно описаны здесь лишь один пример из видов взаимодействий, которые могут быть изучены с этой техникой. Выявление факторов транскрипции, вирусные антигены, и целые вирусы было продемонстрировано ранее, и представляет собой лишь несколько примеров из видов анализа, что IRIS может легко справиться.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Zoiray Technologies, одним из спонсоров и коммерциализации партнером, за оказанную поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
- Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
