Summary
Kwantificering van cellulaire ontsteking in de benadeelde / pathologische CNS door flow cytometrie wordt bemoeilijkt door lipiden / myeline puin dat vergelijkbare grootte en granulatie, om cellen te kunnen hebben, het verminderen van gevoeligheid / nauwkeurigheid. We hebben een geavanceerde celpreparaat methode om myeline vuil te verwijderen en te verbeteren cel detectie door middel van flowcytometrie in de geblesseerde ruggenmerg.
Abstract
Detectie van immuuncellen in de geblesseerde centrale zenuwstelsel (CZS) met behulp van morfologische of histologische technieken is niet altijd voorzien in geval kwantitatieve analyse van de cellulaire ontsteking. Flow cytometrie is een snel alternatief methode om immuuncellen te kwantificeren in de benadeelde hersenen of het ruggenmerg weefsel. Historisch gezien is flowcytometrie is gebruikt om immuuncellen verzameld uit bloed of gedissocieerd milt of zwezerik te kwantificeren, en slechts een paar studies hebben geprobeerd om immuuncellen te kwantificeren in de benadeelde ruggenmerg door middel van flowcytometrie met verse gedissocieerd koord weefsel. Echter, de gedissocieerde ruggenmergweefsel geconcentreerd met myeline puin dat kan worden verward met cellen en verminderen aantal cellen betrouwbaarheid verkregen door de flowcytometer. We hebben een geavanceerde celpreparaat methode met behulp van de OptiPrep gradiënt systeem effectief aparte lipiden / myeline brokstukken van cellen, het verstrekken van gevoelige en betrouwbare kwantificeringen van cellulaire ontsteking in de benadeelde ruggenmerg door flowcytometrie. Zoals beschreven in onze recente studie (Beck & Nguyen et al., Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47), had de OptiPrep celpreparaat verhoogde gevoeligheid voor cellulaire ontsteking op te sporen in de benadeelde ruggenmerg, met graven van specifieke celtypen te correleren met de ernst van het letsel. Kritisch, nieuwe gebruik van deze methode van de eerste karakterisering van acute en chronische cellulaire ontsteking na SCI om een complete cursus voor tijd polymorfonucleaire leukocyten (PMN's, neutrofielen), macrofagen / microglia, en T-cellen over een periode variërend van 2 uur op te nemen 180 dagen na het letsel (dpi), het identificeren van een verrassende nieuwe tweede fase van cellulaire ontsteking. Grondige karakterisering van cellulaire ontsteking gebruik van deze methode kan een beter begrip van zenuwontstekingen in de geblesseerde CZS, en onthullen een belangrijke multifasische onderdeel van ontstekingsprocessen die kritisch zijn voor het ontwerp en de implementatie van rationele therapeutische behandeling strategieën, met inbegrip van zowel basis van cellen en farmacologische interventies voor SCI.
Protocol
1. Dissociatie van ruggenmergweefsel
- Ruggenmerg segmenten T8-T10 van niet-gewonde of kneuzing ruggemerglaesie (verwonding op T9) Sprague Dawley ratten werden ontleed en mechanisch gescheiden met fijne schaar in HBSS bij kamertemperatuur, zoals eerder beschreven: 1. Voorafgaand aan weefsel dissociatie, werden hele ruggenmerg columns gehouden op droog ijs gedurende 5 minuten voor de winning van koord segmenten T8-T10.
- Tissue stukjes werden opgehaald door centrifugeren (1 minuut, 1000 rpm, kamertemperatuur) en enzymatisch gedissocieerd met 2,5 mg trypsine en 5 mg collagenase in 5 ml DME (Dulbecco's Modified Eagle's Media) gedurende 20 minuten bij 37 ° C voor tritureren (~ 10 keer bij kamertemperatuur) met een glas Pasteur pipet (9-inch).
- 10 ml van DME + 10% foetaal runderserum werd toegevoegd aan cellen om enzymatische activiteiten te remmen en daarna werd gefilterd door een 40 um cel zeef. Na een snelle draai, was de cel pellet geresuspendeerd in 6 ml HBSS en overlayed op OptiPrep helling oplossingen die hieronder worden beschreven.
2. Het creëren van OptiPrep gradiënt-oplossingen
- Verdund OptiPrep werd gebouwd door verdunning OptiPrep 1:1 met MOPS buffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4).
- Vier OptiPrep gradiënt oplossingen werden gemaakt door het mengen van 350, 250, 200 of 150 ul verdund met HBSS OptiPrep tot een eindvolume van 1 ml (tabel 1).
- De vier oplossingen werden langzaam en voorzichtig in lagen in een 15 ml conische buis met de minste verdund op de bodem en het meest verdund op de bovenste (Figuur 1A).
3. Scheiden van lipiden / myeline brokstukken van cellen
- 6 ml van gescheiden spinale cellen in HBSS werd zorgvuldig lagen op de top van de OptiPrep gradiënt oplossingen.
- Buis met cellen en gradiënt-oplossingen werd gecentrifugeerd (15 minuten, 1900 rpm of 726 RCF, 20 ° C) met behulp van een Eppendorf Centrifuge 5810R met een swing-emmer rotor (A-4-62), het scheiden van de cel-oplossing in verschillende lagen met lipide / myeline puin (top 7 ml van de buis), gevolgd door drie lagen van neuronen, met ontstekingscellen, glia, en de rode bloedcellen in de pellet. Hoewel de meeste inflammatoire cellen, met inbegrip monocyten, macrofagen, PMN granulocyten en lymfocyten werden gevonden in de pellet, kunnen sommige grote maat-geactiveerde macrofagen zijn te vinden in lagen boven de pellet.
- De lipide / myeline puin laag (top 7 ml) werd zorgvuldig opgezogen en verwijderd. Cellen werden vervolgens gewassen en geresuspendeerd in 2,5 ml HBSS en gebruikt voor immunokleuring hieronder.
4. Immunokleuring van specifieke immuuncellen voor flowcytometrie
- Cells (500 ul) zijn verzameld op het ruggenmerg voorbereidingen waren gepelleteerd en geresuspendeerd in 0,85% ammoniumchloride (opgelost in gedestilleerd water) gedurende 5 minuten aan rode bloedcellen lyseren.
- De cellen werden gewassen met 500 ul HBSS en vervolgens geblokkeerd gedurende 30 minuten in normale konijn of muis serum bij kamertemperatuur.
- Cellen werden gewassen en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met een antilichaam (konijn anti-PMN FITC, nauwkeurige chemische en Wetenschappelijk, Muis anti-rat ED1 Alexa 488, Serotec, of Muis anti-rat CD3 Alexa 488) of isotype IgG-oplossing verdund in HBSS (alles in een 1:100 verdunning), zoals eerder beschreven: 1.
- De cellen werden twee keer gewassen na elke stap hierboven en vervolgens geresuspendeerd in 300 ul HBSS na de laatste stap.
5. Cel kwantitatieve beoordeling door flowcytometrie
- Monsters werden geanalyseerd op een FACS Calibur (Becton-Dickinson) flowcytometer met behulp van Cell Quest-software. 5000 gebeurtenissen per monster werden voorgelezen voor alle monsters, en data-analyse werd aangevuld met Summit (DakoCytomation).
- Flowcytometrische poorten werden ingesteld met behulp van controle IgG-isotype gelabelde cellen of het ruggenmerg cellen van ongedeerd controle dieren tot de uitgangswaarden voor normalisatie in de tijd punten zoals eerder beschreven een. De gemiddelde waarden van een positieve gelabelde cellen werden uitgedrukt als percentage (± SEM) van het gehele monster.
6. Representatieve resultaten:
Het vermogen van een OptiPrep gradiënt aan myeline vuil te verwijderen en te verbeteren immuuncellen detectie door middel van flowcytometrie werd beoordeeld door het kwantificeren van de wervelkolom PMN's bij een dpi (Figuur 1B), de eerder gemelde piek van PMN infiltratie na SCI 1-3. Als alternatief, identiek ontleed ruggenmerg werden enzymatisch gedissocieerd zonder OptiPrep-verwijdering van myeline puin en werden op dezelfde wijze beoordeeld in parallel PMN infiltratie door flowcytometrie. Zoals we al eerder een melding was er een verschuiving in de positie van de gebeurtenissen in monsters geïsoleerd met OptiPrep gradiënt zuivering methode in vergelijking met enzymatische dissociatie alleen, was het aantonen van de percentage van de PMN's gedetecteerd in monsters met intacte myeline puin slechts een fractie (0,5%) van het percentage van de gedetecteerde PMN's (5,1%) in OptiPrep PurifIED monsters (Figuur 1B). Deze gegevens suggereren dat myeline vuil in het weefsel preparaten kunnen flowcytometrische lezingen duister, en laten zien dat het verwijderen van myeline puin verhoogt de gevoeligheid van de immuun cel detectie in de benadeelde ruggenmerg weefsel.
Na te hebben vastgesteld de gevoeligheid van het OptiPrep gradiënt systeem voor mobiele detectie in de benadeelde ruggenmerg, we veranderingen in de cellulaire infiltratie kenmerkt zich gedurende een periode variërend van 2 uur tot 180 dpi en richtte een nieuwe multifasische reactie van cellulaire ontsteking na SCI dat PMN's, macrofagen opgenomen / microglia en T-cellen. Zoals wordt bevestigd door eerdere studies 1-3, PMN's eerst in het snoer op 2 uur na het letsel en piekte op een dpi (figuur 2 en 4). Macrofagen / microglia aan de andere kant 1,4,5, werden niet gedetecteerd in de benadeelde ruggenmerg tot 3 dpi, en een hoogtepunt bereikt in eerste instantie op 7 dpi (figuur 3 & 4). Verrassend genoeg, laten we voor de eerste keer dat macrofagen / microglia een piek voor de tweede keer 60 dpi en bleef verhoogd tot 180 dpi (figuur 3 & 4). Vergelijkbaar met macrofagen / microglia, T-cel infiltratie was voorspeld 7 dpi 5-7 piek, maar flowcytometrie had geen veranderingen in de T-cel nummer te detecteren in de eerste 7 dpi, maar een verhoogd aantal T-cellen werd waargenomen op 9 dpi (1,6%) (figuur 4). Terwijl de T-cel nummer was afneemt met 10 dpi, een aanhoudende T-cel respons werd waargenomen door middel van 180 dpi, op dat moment 4,4% van de cellen werden gelabeld voor CD3 (figuur 4).
Samen vormen deze gegevens tonen aan een tijdsafhankelijke multifasische reactie van cellulaire ontsteking na SCI (figuur 4); de eerste fasen van de cellulaire ontsteking waren samengesteld uit de vroege piek van PMN's 1 dpi, gevolgd door een piek van ED1 + macrofagen / microglia 7 dpi en T -cellen 9 dpi, terwijl de latere fasen werden samengesteld uit alle drie de cellulaire bevolking stijgt na 14 dpi en aanhoudende via 180 dpi, met een opmerkelijke tweede piek van macrofagen / microglia op 60 dpi. Dit tijdsverloop studie en de kwantitatieve gegevens die zijn gegenereerd door middel van flowcytometrie zijn eerder gevalideerd, waarin vergelijkbare resultaten met gegevens van kwantitatieve stereology van immunolabeled ruggemerg 1.
Tabel 1. De voorbereiding van OptiPrep gradiënt voor het verwijderen van myeline puin. Vier OptiPrep gradiënt oplossingen worden gemaakt met behulp van HBSS en verdunde OptiPrep (1:1 verdunning van OptiPrep en MOPS).
Figuur 1. OptiPrep helling dichtheden aparte meest myeline / puin van gewonden ruggenmerg weefsels / cellen en immuuncellen beoordeling door flowcytometrie te verbeteren. (A) Myeline / puin werd gescheiden van de cellen (neuronen, glia en immuuncellen) na het centrifugeren van gescheiden ruggenmergweefsel door middel van een OptiPrep gradiënt gevolgd door aspiratie van myeline / puin laag. (B) PMN nummer in de benadeelde ruggenmerg, waaruit verhoogde gevoeligheid bij het opsporen van PMN's na het verwijderen van vuil (Student's t-test, p = 0,0001). Alle flowcytometrische poorten waren ingesteld met behulp van gelabelde cellen uit ongedeerd dieren; n = 5 per groep, gemiddeld ± SEM. 5000 gebeurtenissen per monster werden voorgelezen voor alle monsters en de gemiddelde waarden van een positieve gelabelde cellen werden uitgedrukt als percentage (± SEM) van het gehele monster.
Figuur 2. Detectie van PMN infiltratie in de benadeelde ruggenmerg door flowcytometrie. Na een matige (200 kd) contusie verwonding op T9, PMN's al snel ging de ruggenmerg vanaf 2 uur (B) na het letsel en een piek een dpi (C). Alle flowcytometrische poorten waren ingesteld met behulp van gelabelde cellen uit ongedeerd dieren (A).
Figuur 3. Detectie van macrofagen / microglia infiltratie in de benadeelde ruggenmerg door flowcytometrie. Na een matige (200 kd) contusie verwonding op T9, ED1 + macrofaag / microgliale aantal groeide in de benadeelde ruggenmerg vanaf 3 dpi (D), een piek acuut op 7 dpi (E), gedaald naar een laag niveau in 14 dpi (F) , voordat u opstaat en een tweede piek op 60 dpi (G), en bleef in de benadeelde ruggenmerg tot 180 dpi (H). IgG-isotype controle etikettering van 7 dpi spinale cellen (B) lieten een minimale antilichaam-labeling achtergrond en geen verschil antilichaam-gelabelde cellen van twee uur post-gewonden (C) of niet gewond (A) dieren. Alle flowcytometrische poorten waren ingesteld met behulp van gelabelde cellen uit ongedeerd dieren.
Tabel 2. Dier monsters in tijdsverloop experimenten. Voor elk tijdstip (0 uur tot 180 dpi), vijf dieren kregen een matige (200 kd) contusie verwonding op T9,en het ruggenmerg weefsels werden beoordeeld door flow cytometrie voor de nummers van PMN's, ED1 + macrofagen / microglia, en CD3 + T-cellen. Waren echter niet alle dierlijke monsters succes teruggewonnen voor PMN (4-5), ED1 (3-5), en CD3 (4-5) flowcytometrische analyses.
Figuur 4. Een tijdsverloop van cellulaire ontsteking in het ruggenmerg na een matige (200 kd) contusie verwonding op T9. Zoals beoordeeld door middel van flowcytometrie, nummers van PMN's, ED1 + macrofagen / microglia, en CD3 + T-cellen piek acuut (1,7, en 9 dpi, respectievelijk) en hield chronisch in de geblesseerde ruggenmerg. N = 3 tot 5 per groep, gemiddeld ± SEM.
Discussion
Het gebruik van flowcytometrie om immuuncellen te kwantificeren in het CZS wordt gecompliceerd door lipiden / myeline content en puin. Naast het interfereren met antilichaam binding en specificiteit, kunnen myeline puin hebben vergelijkbare grootte en granulatie eigenschappen immuuncellen, het verminderen van meet-gevoeligheid en de nauwkeurigheid 8. De roman celpreparaat hier beschreven methode is effectief in het verwijderen van myeline puin en daardoor verbetert de gevoeligheid van flow cytometrie voor veranderingen in de cellulaire ontsteking op te sporen in de geblesseerde ruggenmerg. Bijvoorbeeld, het verwijderen van myeline puin door deze methode verbeterde detectie van immuuncellen in vergelijking met enzymatische dissociatie alone.Critically, nieuwe gebruik van deze methode mag de eerste karakterisering van acute en chronische cellulaire ontsteking na SCI om een complete cursus voor tijd PMN's omvatten, macrofagen / microglia, en T-cellen tot 180 dpi, en wees op een nieuwe tweede fase van cellulaire ontsteking. Deze belangrijke bevindingen van een multifasische onderdeel van ontstekingsprocessen cruciaal belang kan zijn voor het ontwerp en de implementatie van rationele therapeutische behandeling strategieën, met inbegrip van zowel basis van cellen en farmacologische interventies voor SCI.
Het OptiPrep gradiënt systeem is gebruikt om afzonderlijke puin van cellen in het bloed 9 of zuiveren neuronen van de hersenen voor celcultuur doeleinden 10, maar wij hebben gewijzigd en geavanceerde deze methode systeem om myeline puin te scheiden van het ruggenmerg gescheiden cellen, en liet snelle en meer accurate kwantificering van cellulaire ontsteking door flowcytometrie. Deze methode, samen met flowcytometrie is aanzienlijke vooruitgang bieden in ontstekingen onderzoek na CNS verwondingen of pathologische omstandigheden, zoals de meeste studies hebben alleen gekenmerkt cellulaire ontsteking in het CZS met behulp van morfologische en histologische technieken die niet cel-type specifieke of kunnen niet altijd waar kwantitatieve beoordeling. Bovendien hebben een aantal recente studies geprobeerd om immuuncellen te kwantificeren in de benadeelde ruggenmerg door middel van flowcytometrie met verse los snoer weefsel 11,12 of cellen van elkaar gescheiden door het Percoll gradiënt systeem 13, maar deze studies hebben aangetoond van een lage opbrengst cel of ongevoelig detectie van immuuncellen.
Daarentegen is de OptiPrep gradiënt celpreparaat werkwijze verschaft voor de eerste keer, gevoelige en betrouwbare kwantitatieve beoordeling door flow cytometrie op veranderingen van cellulaire ontsteking in reactie op gegradeerde ernst van de verwonding en over een langere tijdsverloop tot 180 dpi. De gevoeligheid en de betrouwbaarheid van flowcytometrische analyse zijn ook afhankelijk van de specificiteit van antilichamen die gebruikt worden om specifieke immuunsysteem celtypen te detecteren, net als flow cytometrie niet toe dat morfologische criteria om verder te onderscheiden celtypes. De specificiteit van antilichamen voor PMN's, macrofagen / microglia of T-vertelt is grondig getest in flowcytometrie voor peritoneale PMN's en alveolaire macrofagen in de cultuur en cellen in het geblesseerde ruggenmergweefsel 1,2. Samen met het OptiPrep gradiënt systeem, zijn deze antilichamen worden gebruikt voor flowcytometrie bijgedragen aan het genereren van een temporele en kwantitatieve analyse van de cellulaire ontsteking die nieuwe inzichten heeft gegeven in de dynamiek van de SCI micro-omgeving, en geïdentificeerd voor het eerst een uitgebreid multifasische reactie van cellulaire ontsteking. Deze Multiphasic respons van cellen na dwarslaesie kan belangrijk zijn om de rol van specifieke celtypen aanwezig zijn op bepaalde tijden na een blessure te onderzoeken of therapeutische interventies tegen specifieke celtypen die kunnen verergeren verwondingen genereren. Bovendien kunnen deze bevindingen helpen bij de ontwikkeling van een passend reden voor de optimale drug-of cel-based interventies voor SCI.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Rebecca Nishi, MS, en de technici van de Christopher Reeve Foundation & Dana Animal Core Facility bij UC Irvine voor hun hulp in dierlijke chirurgie. We danken ook Gabriella Funes, Usha Nekanti en Denisse Moreno voor technische bijstand, manuscript-en video-shoot voorbereidingen en animatie. Dit onderzoek werd ondersteund door NINDS (RO1 NS43428-01 tot AJA), de Verlamming Project van Amerika (PPA-32574 tot HXN), en het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Stem Cell Training Award T1-00008 te HXN. KDB werd ondersteund door de opleiding in de moleculaire en cellulaire neurowetenschappen aan de UC Irvine (T32 NS007444).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Beck, K. D. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. Brain. 133, 433-447 (2010).
- Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).
- Saville, L. R. A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment. J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).
- Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).
- Popovich, P. G. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).
- Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury. J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).
- Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury. J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).
- Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal. J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).
- Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 65, 84-87 (2005).
- Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media. Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).
- Tjoa, T. The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord. J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).
- Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
