Summary
Quantificação da inflamação celular no SNC feridos / patológica por citometria de fluxo é complicada por lipídicas / mielina detritos que podem ter tamanho similar e granulação para as células, diminuindo a sensibilidade / precisão. Temos avançado um método de preparação de células para remover restos de mielina e melhorar a detecção de células por citometria de fluxo na medula lesionada.
Abstract
Detecção de células imunológicas no sistema central feridos nervoso central (SNC), utilizando técnicas morfológicas ou histológicas não forneceu sempre verdadeira análise quantitativa de inflamação celular. Citometria de fluxo é um método rápido alternativa para quantificar as células imunológicas no cérebro lesionado ou tecido da medula espinhal. Historicamente, a citometria de fluxo tem sido utilizada para quantificar células do sistema imunológico coletadas do sangue ou do baço ou timo dissociados, e poucos estudos têm tentado quantificar as células imunológicas na medula lesionada por citometria de fluxo utilizando tecido da medula fresco dissociados. No entanto, o tecido da medula espinhal é dissociada concentrado com os restos de mielina que podem ser confundidos com as células e reduzir a confiabilidade da contagem de células obtidas pelo citômetro de fluxo. Temos avançado um método de preparação de células usando o sistema de gradiente OptiPrep efetivamente detritos lipídicas / mielina em separado a partir de células, proporcionando quantificações sensível e confiável de inflamação celular na medula lesionada por citometria de fluxo. Como descrito em nosso estudo recente (Beck & Nguyen et al, Brain 2010 Fev; 133 (Pt 2):.. 433-47), a preparação celular OptiPrep tinha aumentado a sensibilidade para detectar a inflamação celular na medula lesionada, com contagens de tipos específicos de células correlacionando com a gravidade da lesão. Criticamente, o uso deste método romance desde a primeira caracterização da inflamação aguda e crônica celular após SCI para incluir um curso de tempo completo para leucócitos polimorfonucleares (PMNs, neutrófilos), macrófagos / microglia e células T ao longo de um período que varia de 2 horas para 180 dias pós-lesão (dpi), a identificação de uma fase de romance surpreendente segundo de inflamação celular. Caracterização completa da inflamação celular usando este método pode fornecer uma melhor compreensão da neuroinflamação no SNC feridos, e revelam um componente importante de neuroinflamação multifásica que pode ser crítica para a concepção e implementação de estratégias racionais de tratamento terapêutico, incluindo tanto baseados em células e farmacológicas intervenções para a SCI.
Protocol
1. Dissociação do tecido da medula espinhal
- Segmentos da medula espinhal T8-T10 de não acidentados ou da medula espinhal feridos contusão (lesão no T9) ratos Sprague Dawley foram dissecados e mecanicamente dissociada com uma tesoura bem em HBSS à temperatura ambiente, como descrito anteriormente 1. Antes de tecido dissociação, toda colunas medula espinhal foram mantidos em gelo seco por 5 minutos antes da extração de segmentos de cabo de T8-T10.
- Pedaços de tecido foram recuperadas por centrifugação (1 minuto, 1000 rpm, temperatura ambiente) e enzimaticamente dissociado com 2,5 mg de tripsina e 5 colagenase mg em 5 ml DME (Media Modified Dulbecco Eagle) por 20 minutos a 37 ° C antes de trituração (~ 10 vezes à temperatura ambiente) com uma pipeta Pasteur de vidro (9 polegadas).
- 10 ml de DME + 10% de soro fetal bovino foi adicionado às células para inibir a atividade enzimática e, em seguida, foi filtrada através de um filtro de células 40 mM. Depois de um giro rápido, o pellet celular foi ressuspendido em 6 ml de HBSS e sobrepostos em soluções OptiPrep gradiente descrito abaixo.
2. Criando OptiPrep gradiente soluções
- OptiPrep diluída foi construída diluindo OptiPrep 1:1 com MOPS Tampão (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7.4).
- Quatro soluções OptiPrep gradiente foram feitos através da mistura de 350, 250, 200, ou 150 mL OptiPrep diluído com HBSS a um volume final de 1 ml (Tabela 1).
- As quatro soluções foram lenta e cuidadosamente colocados em camadas em um tubo de 15 ml cônico com menos diluída na parte inferior e mais diluída no topo (Figura 1A).
3. Separar lipídicas / mielina restos de células
- 6 ml de células dissociadas espinhal em HBSS foi cuidadosamente em camadas em cima das soluções gradiente OptiPrep.
- Tubo contendo células e soluções gradiente foi centrifugado (15 minutos, 1900 rpm ou 726 RCF, 20 ° C), utilizando uma centrífuga Eppendorf 5810R com um rotor basculante (A-4-62), separando a solução de células em camadas distintas com lipídios / mielina detritos (top 7 ml do tubo), seguido por três camadas de neurônios, com células inflamatórias, células gliais, e os glóbulos vermelhos no pellet. Embora a maioria das células inflamatórias, como monócitos, macrófagos, granulócitos PMN e linfócitos foram encontrados no sedimento, algumas de grande porte macrófagos ativados podem ser encontradas em camadas acima do sedimento.
- A camada de detritos lipídicas / mielina (top 7 ml) foi cuidadosamente aspirado e removido. As células foram então lavadas e ressuspendidas em 2,5 ml HBSS e usado para imunomarcação abaixo.
4. Imunomarcação de células imunes específicas para citometria de fluxo
- Células (500 mL) coletados de preparações da medula espinhal foram peletizadas e ressuspendidas em solução de cloreto de amônio 0,85% (diluído em água destilada) por 5 minutos para lisar as células vermelhas do sangue.
- Células foram lavadas com 500 mL HBSS e depois bloqueado por 30 minutos em coelhos normais ou soro do mouse em temperatura ambiente.
- Células foram lavadas e incubadas em temperatura ambiente por uma hora com o anticorpo (Rabbit anti-PMN FITC, Chemical precisa e científica; Rato anti-rato ED1 Alexa 488, Serotec, ou rato de rato anti-CD3 Alexa 488) ou solução isotipo IgG diluído em HBSS (todos na diluição 1:100), como descrito anteriormente 1.
- Células foram lavadas duas vezes depois de cada passo acima e então ressuspendido em 300 mL HBSS após a etapa final.
5. Avaliação quantitativa de células por citometria de fluxo
- As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton-Dickinson), utilizando software da Quest Cell. 5.000 eventos por amostra foram lidas para todas as amostras e análise de dados foi concluída com a Summit (DakoCytomation).
- Portões de citometria de fluxo foram definidos usando células controle isotipo IgG rotulados ou células da medula espinhal de animais controle ileso para definir valores de referência para a normalização em momentos como descrito anteriormente 1. Os valores médios de células positivamente marcadas foram expressas como percentagem (± SEM) de toda a amostra.
6. Resultados representativos:
A capacidade de um gradiente OptiPrep para remover restos de mielina e melhorar a detecção de células imunes por citometria de fluxo foi avaliada através da quantificação PMNs espinhal em 1 dpi (Figura 1B), o pico anteriormente relatados de infiltração PMN após SCI 1-3. Alternativamente, identicamente dissecados medulas espinhais foram enzimaticamente dissociado sem OptiPrep remoção de detritos de mielina e foram igualmente avaliados em paralelo para a infiltração PMN por citometria de fluxo. Como já relatado anteriormente 1, houve uma mudança na posição de eventos em amostras isoladas com OptiPrep método de purificação em relação ao gradiente de dissociação enzimática sozinho, demonstrando o percentual de PMNs detectados em amostras com resíduos de mielina intacta era apenas uma fração (0,5%) do percentual de PMN detectado (5,1%) em OptiPrep Purified amostras (Figura 1B). Estes dados sugerem que os restos de mielina em preparações de tecido pode obscurecer leituras de citometria de fluxo, e demonstrar que a remoção dos restos de mielina aumenta a sensibilidade de detecção de células imunes no tecido medula lesionada.
Tendo estabelecido a sensibilidade do sistema de gradiente OptiPrep para a detecção de células na medula lesionada, que caracteriza-se mudanças na infiltração celular ao longo de um período que varia de 2 horas a 180 dpi e estabeleceu uma resposta multifásica romance de inflamação celular após a LM, que incluiu PMN, macrófagos / microglia e células-T. Tal como confirmado por estudos anteriores 1-3, PMN entrou pela primeira vez o cabo de 2 horas pós-lesão e atingiu um máximo de 1 dpi (Figura 2 e 4). Macrófagos / microglia por outro lado, 1,4,5, não foram detectadas na medula lesionada até 3 dpi, e chegou inicialmente em sete dpi (Figura 3 e 4). Surpreendentemente, nós mostramos pela primeira vez que os macrófagos / microglia atingiu pela segunda vez a 60 dpi e permaneceu elevada por 180 dpi (Figura 3 e 4). Similar aos macrófagos / microglia, infiltração de células T foi previsto para o pico 05-07 julho dpi, no entanto, citometria de fluxo não detectou qualquer mudança no número de células T nos primeiros 7 dpi, embora um elevado número de células T foi detectada às 9 dpi (1,6%) (Figura 4). Enquanto T-cell número foi diminuindo em 10 dpi, uma resposta de células T persistente foi observada em 180 dpi, momento em que 4,4% de células foram marcadas para CD3 (Figura 4).
Juntos, estes dados demonstram uma resposta dependente do tempo multifásica de inflamação celular após SCI (Figura 4); as fases iniciais de inflamação celular eram compostas do pico precoce de PMNs 1 dpi seguido de um pico de ED1 + macrófagos / microglia 7 dpi e T células-9 dpi, enquanto as fases posteriores eram compostas de três populações celulares subindo depois de 14 dpi e persistindo em 180 dpi, com um pico notável segundo de macrófagos / microglia em 60 dpi. Este estudo timecourse e os dados quantitativos gerados por citometria de fluxo foram validados anteriormente, mostrando resultados comparáveis aos dados coletados de estereologia quantitativa de immunolabeled seções da medula espinhal 1.
Tabela 1. Preparação de OptiPrep gradiente para a remoção dos restos mielínicos. Quatro soluções gradiente OptiPrep são feitas com HBSS e OptiPrep diluída (1:1 diluição de OptiPrep e MOPS).
Figura 1. Densidades de gradiente OptiPrep mais separados mielina / restos de feridos da medula espinhal tecidos / células e melhorar a avaliação de célula imunológica por citometria de fluxo. (A) A mielina / detritos foi separado a partir de células (neurônios, células gliais e células do sistema imunológico) após a centrifugação do tecido da medula espinhal através dissociada um gradiente OptiPrep seguida de aspiração de mielina / detritos camada. (B) Número de PMN na medula lesionada, mostrando uma maior sensibilidade na detecção de PMNs após a remoção de detritos (Student t-test, p = 0,0001). Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso; n = 5 por grupo, média ± SEM. 5.000 eventos por amostra foram lidas para todas as amostras e os valores médios de células positivamente marcadas foram expressas como percentagem (± SEM) de toda a amostra.
Figura 2. Detecção de infiltração PMN na medula lesionada por citometria de fluxo. Depois de uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9, PMNs rapidamente entrou na medula espinhal a partir de 2 horas (B) pós-lesão e pico 1 dpi (C). Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso (A).
Figura 3. Detecção de macrófagos / microglia infiltração na medula lesionada por citometria de fluxo. Depois de uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9, ED1 + número de macrófagos / microglia aumento na medula lesionada a partir de 3 dpi (D), atingiu o pico de forma aguda em 7 dpi (E), caiu para níveis baixos em 14 dpi (F) , antes de subir para um segundo pico em 60 dpi (G), e permaneceu na medula lesionada até 180 dpi (H). IgG rotulagem controle de isotipo de 7 dpi células da coluna (B) mostrou fundo anticorpo rotulagem mínimas e nenhuma diferença para as células-anticorpo rotulado de 2 horas pós-lesão (C) ou não lesionado (A) animais. Todos os portões de citometria de fluxo foram definidos usando células marcadas de animais ileso.
Tabela 2. Amostras de animais em experimentos timecourse. Para cada ponto de tempo (0 hr a 180 dpi), cinco animais receberam uma lesão no contusão moderada (200 kd) em T9,e tecidos da medula espinhal foram avaliadas por citometria de fluxo para o número de PMNs, ED1 + macrófagos / microglia e CD3 + T-cells. No entanto, nem todas as amostras de animais foram recuperados com sucesso para o PMN (4-5), ED1 (3-5), e CD3 (4-5) por citometria de fluxo análises.
Figura 4. A timecourse de inflamação celular na medula espinhal após uma lesão contusão moderada (200 kd) em T9. Avaliada por citometria de fluxo, o número de PMNs, ED1 + macrófagos / microglia e CD3 + T-cells pico de forma aguda (1,7 e 9 dpi, respectivamente) e persistiu cronicamente na medula lesionada. N = 3 a 5 por grupo, média ± SEM.
Discussion
O uso da citometria de fluxo para quantificar células do sistema imunológico no SNC é complicada por lipídicas / mielina conteúdo e detritos. Além de interferir com a ligação de anticorpos e especificidade, os restos de mielina pode ter tamanho similar e as propriedades de granulação com células do sistema imunológico, diminuindo a sensibilidade de medição e precisão 8. O romance método de preparação de células aqui descrito é eficaz na remoção de detritos de mielina e, assim, melhora a sensibilidade da citometria de fluxo para detectar mudanças na inflamação celular na medula lesionada. Por exemplo, a remoção dos restos mielínicos por este método de detecção aprimorada de células imunes em comparação com dissociação enzimática alone.Critically, o uso romance deste método permitiu a caracterização da primeira aguda e crônica a inflamação celular após a LM para incluir um curso de tempo completo para PMNs, macrófagos / microglia e células-T até 180 dpi, e identificou uma fase de segundo romance de inflamação celular. Esses importantes achados de um componente de neuroinflamação multifásica pode ser crucial para a concepção e implementação de estratégias racionais de tratamento terapêutico, incluindo intervenções ambos baseados em células e farmacológicas para o SCI.
O sistema de gradiente OptiPrep tem sido usado para separar os restos de células no sangue 9, ou neurônios purificar a partir do cérebro para fins de cultura de células 10, no entanto, temos modificado e avançado método este sistema para separar os restos de mielina das células da medula espinhal dissociados, e permitiu quantificação rápida e mais precisas de inflamação celular por citometria de fluxo. Este método, juntamente com a citometria de fluxo é susceptível de proporcionar avanços significativos na pesquisa inflamação após CNS lesões ou condições patológicas, como a maioria dos estudos apenas caracteriza a inflamação celular no SNC através de técnicas morfológicas e histológicas que não são células de tipo específico ou não pode sempre fornecer informações verdadeiras avaliação quantitativa. Além disso, alguns estudos recentes têm tentado quantificar as células imunológicas na medula lesionada por citometria de fluxo utilizando tecido da medula fresco dissociada 11,12 ou células separadas por gradiente de Percoll sistema de 13, no entanto, esses estudos têm demonstrado tanto colheitas de células de baixa ou insensível detecção de células do sistema imunológico.
Em contraste, o gradiente OptiPrep método de preparação de células forneceu, pela primeira vez, sensível e confiável de avaliação quantitativa por citometria de fluxo para mudanças de inflamação celular em resposta à gravidade da lesão classificados e mais de uma timecourse estendida até 180 dpi. A sensibilidade ea confiabilidade da análise de citometria de fluxo também dependem da especificidade dos anticorpos usados para detectar tipos específicos de células imunes, como a citometria de fluxo não permite critérios morfológicos para distinguir ainda mais tipos de células. A especificidade de anticorpos para PMNs, macrófagos / microglia ou T-conta tem sido testado exaustivamente em citometria de fluxo para PMNs peritoneal e nos macrófagos alveolares em cultura e as células do tecido da medula espinhal 1,2 feridos. Juntamente com o sistema de gradiente OptiPrep, esses anticorpos usados para citometria de fluxo têm contribuído para a geração de uma análise temporal e quantitativa da inflamação celular que tem proporcionado uma nova visão sobre a dinâmica do microambiente SCI, e identificado pela primeira vez uma resposta estendida multifásica de inflamação celular. Esta resposta multifásica de células após a LM pode ser importante para investigar o papel de tipos específicos de células presentes em momentos específicos após a lesão ou gerar intervenções terapêuticas contra tipos específicos de células que podem agravar os ferimentos. Além disso, estes resultados podem ajudar no desenvolvimento de um raciocínio apropriado para as intervenções ideal drogas ou baseados em células de SCI.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Rebecca Nishi, MS, e os técnicos da Fundação Christopher Reeve & Dana Facility Núcleo Animal na UC Irvine por sua ajuda na cirurgia animal. Agradecemos também a Gabriella Funes, Usha Nekanti e Denisse Moreno por técnicos preparados manuscrito, assistência e gravar vídeo e animação. Esta pesquisa foi suportada pelo NINDS (RO1 NS43428-01 a AJA), o Projeto de Paralisia da América (PPA-32574 para HXN), e do Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM) Stem Award Treinamento Celular T1-00008 para HXN. KDB foi apoiado pelo programa de formação em neurociência molecular e celular na UC Irvine (T32 NS007444).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Beck, K. D. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. Brain. 133, 433-447 (2010).
- Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).
- Saville, L. R. A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment. J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).
- Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).
- Popovich, P. G. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).
- Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury. J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).
- Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury. J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).
- Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal. J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).
- Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 65, 84-87 (2005).
- Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media. Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).
- Tjoa, T. The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord. J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).
- Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
