Summary
Kvantifiering av cellulär inflammation i skadade / patologiska CNS med flödescytometri kompliceras av lipid / myelin skräp som kan ha liknande storlek och granulering till celler, minskar känsligheten / noggrannhet. Vi har avancerat en metod cellberedningen att ta bort myelinet skräp och förbättra cell upptäckt med flödescytometri i den skadade ryggmärgen.
Abstract
Upptäckt av immunceller i den skadade centrala nervsystemet (CNS) genom morfologisk eller histologiska tekniker har inte alltid ges sant kvantitativ analys av cellulär inflammation. Flödescytometri är en sammanfattning av alternativ metod för att kvantifiera immunceller i den skadade hjärnan eller ryggmärgen vävnad. Historiskt sett har flödescytometri använts för att kvantifiera immunceller som samlas in från blod eller dissocierade mjälte eller bräss, och endast ett fåtal studier har försökt att kvantifiera immunceller i den skadade ryggmärgen med flödescytometri med färska dissocierade sladd vävnad. Dock är dissocierade ryggmärgsvävnad koncentrerad med myelin skräp som kan misstas för celler och minska celltal tillförlitlighet erhålls genom flödescytometern. Vi har avancerat en metod cellberedningen med OptiPrep lutning systemet för att effektivt skilja lipid / myelin skräp från celler, vilket ger känsliga och tillförlitliga kvantifieringar av cellulära inflammation i den skadade ryggmärgen med flödescytometri. Som beskrivs i vår senaste studie (Beck & Nguyen et al, Brain 2010 februari, 133 (Pt 2):.. 433-47) hade OptiPrep cellberedningen ökad känslighet för att upptäcka cellulär inflammation i den skadade ryggmärgen, med fall av specifika celltyper korrelera med skadornas svårighetsgrad. Kritiskt, förutsatt roman användning av denna metod den första karakterisering av akut och kronisk cellulär inflammation efter SCI att inkludera en komplett tidsintervall polymorfonukleära leukocyter (PMNs, neutrofiler), makrofager / mikroglia och T-celler under en period som sträcker sig från 2 timmar till 180 dagar efter skada (dpi), identifiera en överraskande roman andra fas av cellulär inflammation. Grundlig beskrivning av cellulära inflammationen med den här metoden kan ge en bättre förståelse för neuroinflammation i den skadade CNS, och avslöja en viktig multiphasic del av neuroinflammation som kan vara avgörande för utformningen och genomförandet av en rationell terapeutisk behandling strategier, inklusive både cellbaserade och farmakologiska interventioner för SCI.
Protocol
1. Dissociation av ryggmärg
- Ryggmärgen segment T8-T10 av icke-skadade eller kontusion ryggmärgsskadade (skada vid T9) Sprague Dawley råttor dissekeras och mekaniskt dissocierade med fina sax i HBSS vid rumstemperatur, som tidigare beskrivits 1. Före vävnadsdissociering var hela ryggmärgen kolumnerna förvaras på torr-is i 5 minuter innan utvinning av sladden segment T8-T10.
- Tissue bitar hämtades genom centrifugering (1 minut, 1000 rpm, rumstemperatur) och enzymatiskt dissocierade med 2,5 mg trypsin och 5 mg kollagenas i 5 ml DME (Dulbecco ändrade Eagles Media) under 20 minuter vid 37 ° C innan trituration (~ 10 gånger vid rumstemperatur) med ett glas pasteurpipett (9-inches).
- 10 ml av DME + 10% fetalt bovint serum inkom celler att hämma enzymaktiviteten och därefter filtreras genom ett 40 ìm cell sil. Efter en snabb dragning, var cellpelleten återsuspenderade i 6 ml HBSS och overlayed på OptiPrep lutning lösningar som beskrivs nedan.
2. Skapa OptiPrep lutning lösningar
- Utspädd OptiPrep byggdes genom att späda OptiPrep 1:1 med MOPS Buffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4).
- Fyra OptiPrep lutning lösningar gjordes genom att blanda 350, 250, 200 eller 150 l utspädd OptiPrep med HBSS till en slutlig volym på 1 ml (tabell 1).
- De fyra lösningar var långsamt och försiktigt placeras i lager i en 15 ml konisk tub med minsta späda på botten och de späda på toppen (Figur 1A).
3. Separera lipid / myelin skräp från celler
- 6 ml dissocierade spinal celler i HBSS var omsorgsfullt lager ovanpå OptiPrep lutning lösningar.
- Rör som innehåller celler och lösningar lutning var centrifugeras (15 minuter, 1900 rpm eller 726 RCF, 20 ° C) med hjälp av en Eppendorf Centrifug 5810R med en swing-hink rotor (A-4-62), som skiljer cellen lösningen i olika lager med fett / myelin skräp (topp 7 ml rör), följt av tre lager av nervceller, med inflammatoriska celler, Glia, och röda blodkroppar i pelleten. Även om de flesta inflammatoriska celler, bland annat monocyter, makrofager, granulocyter PMN och lymfocyter fanns i pellets kan vissa stora och medelstora-aktiverade makrofager finns i lager ovanför pelleten.
- Den lipid / myelin skräp skiktet (top 7 ml) var försiktigt aspireras och tagits bort. Celler var sedan tvättas och suspenderade i 2,5 ml HBSS och används för immunolabeling nedan.
4. Immunolabeling av specifika immunceller för flödescytometri
- Celler (500 l) samlas in från ryggmärgen förberedelser pelleterad och suspenderade i 0,85% ammoniumklorid (utspätt i destillerat vatten) i 5 minuter för att lysera röda blodkroppar.
- Cellerna sköljdes med 500 l HBSS och sedan blockeras i 30 minuter i normala kanin eller mus serum vid rumstemperatur.
- Celler var tvättade och inkuberas i rumstemperatur i 1 timme med antikropp (Kanin anti-PMN FITC, Noggrann kemisk och vetenskaplig, mus-anti-råtta ED1 Alexa 488, Serotec, eller mus-anti-råtta CD3 Alexa 488) eller isotyp IgG lösning utspädd i HBSS (alla på 1:100 utspädning), beskrivs som tidigare 1.
- Celler spolades två gånger efter varje steg ovan och sedan suspenderade i 300 l HBSS efter det sista steget.
5. Cell kvantitativ bedömning av flödescytometri
- Proverna analyserades på en FACS Calibur (Becton-Dickinson) flödescytometer med hjälp av programvara Cell Quest. 5000 händelser per prov var läsning för alla prover och analys av data avslutades med Summit (DakoCytomation).
- Flödescytometrisk grindar sattes med hjälp av kontroll-IgG isotyp märkta celler eller spinal celler sladden från oskadade djur i kontrollgruppen att ställa utgångsvärdena för normalisering över tid punkter som beskrivits tidigare 1. De genomsnittliga värdena av positivt märkta celler var uttryckt som procent (± SEM) av hela provet.
6. Representativa resultat:
Förmågan hos en OptiPrep gradient att ta bort myelinet skräp och förbättra immunceller upptäckt med flödescytometri utvärderades genom att kvantifiera spinal PMNs vid 1 dpi (Figur 1B), den tidigare rapporterade toppen av PMN infiltration efter SCI 1-3. Alternativt var identiskt dissekerades ryggmärgen enzymatiskt dissocierade utan OptiPrep-borttagning av myelin skräp och var lika utvärderats parallellt för PMN infiltration av flödescytometri. Som vi tidigare rapporterat 1, var det en förskjutning av händelser i prover isolerade med OptiPrep gradient reningsmetod jämfört med enzymatisk dissociation ensam, demonstrerade andelen PMNs upptäcktes i prover med intakt myelin skräp bara en bråkdel (0,5%) av andelen upptäckta PMNs (5,1%) i OptiPrep PurifIED prover (Figur 1B). Dessa data tyder på att myelin skräp i vävnaden preparat kan skymma flödescytometrisk uppläsningar, och visar att avlägsnandet av myelin skräp ökar känsligheten av immunceller upptäckt i den skadade ryggmärgen vävnad.
Efter att ha konstaterat känsligheten på OptiPrep gradienten för cellen att upptäcka i den skadade ryggmärgen, som kännetecknas vi förändringar i cellulär infiltration under en period som sträcker sig från 2 timmar till 180 dpi och etablerade en ny multiphasic svar av cellulär inflammation efter SCI som inkluderade PMNs, makrofager / mikroglia och T-celler. Vilket bekräftas av tidigare studier 1-3, in PMNs först sladden vid 2 timmar efter skada och nådde en topp på 1 dpi (Figur 2 & 4). Makrofager / mikroglia däremot 1,4,5, inte registreras i den skadade ryggmärgen tills 3 dpi och nådde inledningsvis till 7 dpi (Figur 3 & 4). Förvånande nog visar vi för första gången att makrofager / mikroglia nådde en topp för andra gången 60 dpi och förblev förhöjd med 180 dpi (Figur 3 & 4). Liknande makrofager / mikroglia, T-cell infiltration förutspåddes till topp 7 dpi 5-7, men gjorde flödescytometri inte upptäcka några förändringar i T-cell nummer i den första 7 dpi, trots ett förhöjt antal T-celler upptäcktes kl 9 dpi (1,6%) (Figur 4). Även T-cell var antalet minskat med 10 dpi, en ihållande T-cells svar observerades i 180 dpi, då 4,4% av celler som var märkta för CD3 (Figur 4).
Tillsammans utgör dessa uppgifter visar en tidsberoende multiphasic respons cellulär inflammation efter SCI (Figur 4), de inledande faserna av cellulär inflammation bestod av den tidigt maximala PMNs 1 dpi följs av en topp på ED1 + makrofager / mikroglia 7 dpi och T -celler 9 dpi, medan de senare faserna bestod av alla tre cellpopulationer stigande efter 14 dpi och kvarstående i 180 dpi, med en noterbar andra topp av makrofager / mikroglia vid 60 dpi. Detta tidsförloppet studien och den kvantitativa data som genereras av flödescytometri har validerats tidigare, visar jämförbara resultat med uppgifter som samlats in från kvantitativa stereology av immunolabeled ryggmärgen avsnitt 1.
Tabell 1. Beredning av OptiPrep lutning för avlägsnande av myelin skräp. Fyra OptiPrep lutning lösningar är gjorda med HBSS och efter utspädning OptiPrep (1:1 utspädning av OptiPrep och moppar).
Figur 1. OptiPrep lutning tätheter separata mest myelin / skräp från skadade ryggmärgen vävnader / celler och förbättra immunceller bedömning av flödescytometri. (A) Myelin / skräp skildes från celler (neuroner, Glia och immunceller) efter centrifugering av dissocierade ryggmärg genom en OptiPrep gradient följt av aspiration av myelin / skräp lager. (B) PMN nummer i den skadade ryggmärgen, som visar ökad känslighet i att upptäcka PMNs efter avlägsnande av skräp (Students t-test, p = 0,0001). Alla flödescytometrisk grindar sattes med hjälp av märkta celler från oskadade djur, n = 5 per grupp, medelvärde ± SEM. 5000 händelser per prov lästes för alla prover och medelvärdet för positivt märkta celler var uttryckt som procent (± SEM) av hela provet.
Figur 2. Detektion av PMN infiltration i den skadade ryggmärgen med flödescytometri. Efter en måttlig (200 kd) kontusion skada på T9 gick PMNs snabbt ryggmärgen börjar 2 timmar (B) efter skada och topp 1 dpi (C). Alla flödescytometrisk grindar sattes med hjälp av märkta celler från oskadade djur (A).
Figur 3. Upptäckt av makrofager / mikroglia infiltration i den skadade ryggmärgen med flödescytometri. Efter en måttlig (200 kd) kontusion skada på T9, ED1 + makrofag / microglial antal ökat i den skadade ryggmärgen med början vid 3 dpi (D), toppade akut vid 7 dpi (E), sjönk till låga nivåer vid 14 dpi (F) , och steg till en andra topp vid 60 dpi (G), och förblev i den skadade ryggmärgen upp till 180 dpi (H). IgG isotypisk kontroll märkning av 7 dpi spinal celler (B) visade minimala antikropp-märkning bakgrund och ingen skillnad för antikropp-märkta celler från 2 timmar efter skadade (C) eller oskadade (A) djur. Alla flödescytometrisk grindar sattes med hjälp av märkta celler från oskadade djur.
Tabell 2. Animal prover i tidsförloppet experiment. För varje tidpunkt (0 tim till 180 dpi), fick fem djur en måttlig (200 kd) kontusion skada på T9,och ryggmärgen vävnader bedömdes av flödescytometri för antalet PMNs, ED1 + makrofager / mikroglia, och CD3 + T-celler. Dock var inte alla djur prov återhämtat framgångsrikt för PMN (4-5), ED1 (3-5) och CD3 (4-5) flödescytometrisk analyser.
Figur 4. En tidsförloppet för cellulär inflammation i ryggmärgen efter en måttlig (200 kd) kontusion skada på T9. Enligt bedömning av flödescytometri, antal PMNs, ED1 + makrofager / mikroglia och CD3 + T-celler kulminerat akut (1,7 och 9 dpi, respektive) och kvarstod kroniskt i den skadade ryggmärgen. N = 3 till 5 procent grupp, medelvärde ± SEM.
Discussion
Användningen av flödescytometri att kvantifiera immunceller i CNS kompliceras av lipid / myelin innehåll och skräp. Förutom att störa antikroppsbindning och specificitet kan myelin skräp har liknande storlek och egenskaper granulering till immunceller minskar mätkänslighet och noggrannhet 8. Romanen cellberedningen metoden som beskrivs här är effektiva för att avlägsna myelin skräp och därmed förbättrar känsligheten för flödescytometri för att upptäcka förändringar i cellulär inflammation i den skadade ryggmärgen. Till exempel avlägsnande av myelin skräp med denna metod förbättrad detektion av immunceller jämfört med enzymatisk dissociation alone.Critically tillät roman användning av denna metod den första karakterisering av akut och kronisk cellulär inflammation efter SCI att inkludera en komplett gången kurs för PMNs, makrofager / mikroglia och T-celler upp till 180 dpi, och identifierade en ny fas av cellulär inflammation. Dessa viktiga resultaten av en multiphasic del av neuroinflammation kan vara avgörande för utformningen och genomförandet av rationella terapeutisk behandling strategier, inklusive både cellbaserade och farmakologiska interventioner för SCI.
Det OptiPrep lutning systemet har använts för att skilja skräp från celler i blod 9 eller rena nervceller från hjärnan för ändamål cellodling 10, men vi har ändrat och avancerade metoden för att skilja myelin skräp från ryggmärgen dissocierade celler, och tillät snabb och mer exakt kvantifiering av cellulär inflammation genom flödescytometri. Denna metod tillsammans med flödescytometri kommer sannolikt att ge betydande framsteg inom inflammationsforskning efter CNS-skador eller sjukdomstillstånd, eftersom de flesta studier har bara präglats cellulära inflammationen i CNS med hjälp av morfologiska och histologiska tekniker som inte är celltyp specifika eller kan inte alltid sant kvantitativ bedömning. Dessutom har ett par nya studier försökt att kvantifiera immunceller i den skadade ryggmärgen med flödescytometri med färska dissocierade sladden vävnad 11,12 eller celler skiljs åt av Percoll gradient systemet 13, men har dessa studier visat antingen låg cell avkastning eller okänsliga upptäckt av immunceller.
Däremot har OptiPrep gradient cellberedningen metod som för första gången, känsliga och tillförlitliga kvantitativ bedömning med flödescytometri till förändringar av cellulär inflammation som svar på graderade skadornas svårighetsgrad och under en längre tidsförloppet upp till 180 dpi. Känslighet och tillförlitlighet flödescytometrianalyser också bero på specifika antikroppar som används för att påvisa specifika immunceller typer, gör som flödescytometri inte tillåta morfologiska kriterier för att ytterligare skilja celltyper. Specificiteten av antikroppar för PMNs, makrofager / mikroglia eller T-berättar har testats noggrant i flödescytometri för peritoneal PMNs och alveolära makrofager i kultur och celler i den skadade ryggmärgen vävnad 1,2. Tillsammans med OptiPrep lutning systemet har dessa antikroppar används för flödescytometri bidragit till uppkomsten av en tidsmässig och kvantitativ analys av cellulära inflammation som har gett nya insikter om dynamiken i SCI mikromiljö, och identifierades för första gången en längre multiphasic svar av cellulära inflammation. Denna multiphasic respons celler efter SCI kan vara viktigt att undersöka betydelsen av specifika celltyper närvarande på bestämda tider efter skada eller generera terapeutiska åtgärder mot specifika celltyper som kan förvärra skadorna. Dessutom kan dessa resultat bidra till utvecklingen av en lämplig motivering för den optimala drogen eller cellbaserade insatser för SCI.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Rebecca Nishi, MS, och tekniker för Christopher och Dana Reeve Foundation Animal Core Facility vid UC Irvine för deras hjälp i djur kirurgi. Vi vill också tacka Gabriella Funes, Usha Nekanti och Denisse Moreno för tekniskt stöd, manus och video shoot förberedelser och animation. Denna forskning stöds av NINDS (RO1 NS43428-01 till AJA), den Förlamning Project of America (PPA-32.574 till HXN) och California Institute för regenerativ medicin (CIRM) Stem Cell Utbildning Award T1-00008 till HXN. KDB stöddes av utbildningen i molekylära och cellulära neurovetenskap vid UC Irvine (T32 NS007444).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Beck, K. D. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. Brain. 133, 433-447 (2010).
- Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).
- Saville, L. R. A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment. J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).
- Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).
- Popovich, P. G. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).
- Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury. J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).
- Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury. J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).
- Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal. J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).
- Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 65, 84-87 (2005).
- Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media. Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).
- Tjoa, T. The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord. J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).
- Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
