Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات

doi: 10.3791/2699 Published: February 17, 2011

Summary

هذه الرسالة يقدم بيانات عن دقة واستنساخ من معمل للأشعة فوق البنفسجية VIS BioSpec النانو لdsDNA الكميات والبروتين. حتى مع كميات صغيرة جدا (من 1 إلى 2 لتر) ، واستنساخ ممتازة ، في حين أن وظيفة المسح الآلي يحسن الإنتاجية والحد الأدنى من النتائج في المرحل عن نتائج أكثر دقة.

Abstract

تقدمت إجراءات الكميات حمض النووي بشكل ملحوظ في العقود الثلاثة الماضية. أكثر وأكثر ، ويتفق علماء البيولوجيا الجزيئية تتطلب صغيرة الحجم تحليل عينات الحمض النووي لتجاربهم. وBioSpec نانو يوفر حلا محتملا للمشاكل غير دقيقة النتائج غير استنساخه ، الكامنة في الأساليب الحالية الكميات الحمض النووي ، عبر البصريات والمتخصصة للكشف عن حساسية PDA. وBioSpec النانو وأيضا وظيفة مثل هذه الآلية التي تتم تصاعد مستمر ، والقياس ، والتنظيف في الصك ، وبالتالي القضاء على تنسيب شاقة ، والمتكررة ، وغير متناسقة من عنصر والألياف البصرية والتنظيف اليدوي.

في هذه الدراسة ، يقدم بيانات عن الكمي من الحمض النووي والبروتينات ، فضلا عن استنساخ القياس ودقتها. الاتصال الآلي عينة المسح السريع ويسمح القياس في ثلاث ثوان ، مما أدى إلى سرعة ممتازة. ويتم تحليل البيانات خارج باستخدام الميزات المضمنة في البرنامج. الصيغة المستخدمة لحساب تركيز الحمض النووي هو :

عينة تركيز = DF · (OD260 - OD320) · NACF (1)

حيث DF = عامل تخفيف العينة وNACF = تركيز حمض النووي عامل.

تم تعيين تركيز الأحماض النووية عامل وفقا لتحليلها المختارة 1.

ويمكن التعبير عن النتائج تركيز البروتين كما ميكروغرام / مل أو الشامات / L عن طريق إدخال القيم وE280 الوزن الجزيئي على التوالي. عندما يتم إدخال القيم لبقايا صور ، والتربتوفان سيستين (SS السندات) في التبويب e280Calc ، يتم حساب قيم معامل الانقراض كما E280 = 5500 × (بقايا التربتوفان) + 1490 × (بقايا صور) + 125 × (SS السندات السيستين) . يتم استخدام القيمة E280 بواسطة برنامج لحساب التركيز.

بالإضافة إلى تحديد تركيز الأحماض النووية والبروتين ، ويمكن استخدام BioSpec نانو باعتبارها معمل الصغيرة الحجم جدا لanalytes أخرى كثيرة أو على شكل معمل قياسي باستخدام الخلايا طول المسار 5 ملم.

Protocol

1. إجراءات الكميات الحمض النووي

  1. بدوره على الصك.
  2. افتح البرنامج BioSpec نانو من أجهزة الكمبيوتر المكتبية.
  3. انقر فوق علامة التبويب حمض dsDNA الأحماض النووية البسيط (الشكل 1).
  4. يقوم البرنامج بإنشاء اتصال مع الصك وتشغيل تسلسل التهيئة. هذا يتحقق من أن يتم تنفيذ هذا الصك وفقا للمواصفات.
  5. حدد 0.7 أو 0.2 ملم على طول المسار المنزلق. هذا يحدد طول المسار ، وتستند جميع الحسابات على طول المسار المحدد.
  6. المقبل في BioSpec نانو إعداد برنامج الإعداد ، انقر فوق Autowiping. حدد 1 أو 2.
  7. 2 ميكرولتر ماصة (0.7 ملم) H 2 O أو عازلة على قاعدة التمثال.
  8. فوق فارغة أو F6 لقياس فارغة. يتم تحديد طول المسار في كل مرة جديدة لا بد من تسجيل فارغة.
  9. ماصة 2 ميكرولتر من العينة على قاعدة التمثال.
  10. انقر فوق ابدأ في البرنامج أو تضغط على الزر بدء على الصك. في إطار التحركات العليا لاجراء اتصالات مع قطرات العينة. ويمكن ملاحظة ومضات زينون.
  11. كرر نفس العينة 3 مرات لتحديد تكرارية.
  12. يتم حفظ جميع البيانات كما هو مسجل. برعم الملف.
  13. انقر لحفظ كملف PDF. أو ملف csv حفظ PDF / csv أو F9. ويمكن أيضا أن يتم حفظ النتائج كملف CSV. باستخدام الاختيار المناسب في التبويب حفظ.

2. بروتوكول للبروتين الكميات

  1. تحديد بروتين الكميات التبويب (الشكل 2).
  2. أدخل E280 معامل الانقراض ، إذا كان معروفا.
  3. إذا كان لا يعرف ذلك باستخدام حساب E280 e280Calc.
  4. حدد 0.7 أو 0.2 ملم على طول المسار المنزلق.
  5. انقر فوق إعداد ، Autowiping الإعداد. اختيار ما بين 2 أو أعلى.
  6. 3 ماصة ميكرولتر (على 0.2 ملم) H 2 O أو عازلة على قاعدة التمثال.
  7. فوق فارغة أو F6 لقياس فارغة.
  8. 3 ماصة ميكرولتر من عينة البروتين على قاعدة التمثال.
  9. انقر فوق ابدأ في البرنامج أو تضغط على الزر بدء على الصك.
  10. كرر نفس العينة 3 مرات لتحديد تكرارية.
  11. يتم حفظ جميع البيانات كما هو مسجل. برعم الملف
  12. انقر لحفظ كملف PDF. أو ملف csv حفظ PDF / csv أو F9.

3. ممثل النتائج :

1. نتائج الحمض النووي للالكميات

الشكل 3 يعرض البيانات من القياسات على عينة نموذجية مضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. وتبين ايضا تركيز وتحسب نسبة OD 260/280. الشكل 4 يحتوي على نتائج الاختبار لاستنساخ الحمض النووي الكميات. البيانات في أرقام 3 و 4 تظهر النتائج واستنساخه للغاية كما يتضح من انخفاض مستوى الانحراف النسبية 0.26 ٪.

ملاحظة 1 :

يمكن عدم دقة في الكميات الحمض النووي تنشأ من وجود مكونات العازلة التي يمكن أن تمتص الأشعة فوق البنفسجية في المنطقة. ومن الضروري أيضا استخدام محلول العينة متجانسة. وكمية العينة التي يجري pipetted فقط ميكرولتر 1-2 ، pipetting دقيق للكميات دقيقة من دون إدخال أي فقاعات هو مطلوب.

2. نتائج ل الكميات البروتين

الشكل 5 يمثل البروتين تحليل تركيز لجيش صرب البوسنة. ويستند تركيز البروتين ميكروغرام / مل على قيمة E280. ويبين الشكل 6 تحليل استنساخ. يتضح من الانحراف القياسي النسبي 0.51 ٪ أن BioSpec نانو التدابير تركيز على وجه التحديد -- وليس فقط لالحمض النووي ولكن أيضا للبروتينات.

ملاحظة 2 : العوامل التي تؤثر على تركيز البروتين

دقة تحديد تركيز البروتين هو ممكن عندما يكون هناك الحد الأدنى من آثار عدم الاستقرار الناتج عن درجة الحموضة ، ومخازن ، ودرجة الحرارة ، أو الإضافات. البروتين النقي يمر معظم الخطوات المختلفة للتجهيز ، وبالتالي فمن الممكن أن البروتين قد تحتوي على السطحي أو غيرها من المواد المضافة التي قد تتداخل مع تشكيل الحبرية. للحصول على عينات من هذا القبيل ، وذلك باستخدام طول المسار 5 مم خلية الكوارتز ينصح بشدة.

الشكل 1
اختيار الرقم 1 الحليلة. نافذة لمضاعفة الكميات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل

الشكل 2
اختيار الشكل الحليلة 2. الكميات غير نافذة للبروتين المسمى

الشكل 3
بيانات الممثل الشكل 3. الحمض النووي للالكميات

الشكل 4
بيانات التكاثر الشكل 4. الحمض النووي للالكميات

الشكل 5
الشكل 5. بيانات عن الكميات الممثل البروتين

"الشكل الشكل 6. بيانات عن الكميات البروتين التكاثر

Discussion

فقد تم تصميم BioSpec نانو لحل القضايا الراهنة المتأصلة في أساليب الكميات الحمض النووي ، مثل نتائج غير متناسقة ومملة العمل اليدوي. كل قياس يأخذ 3 ثوان فقط ، مما يسمح للعالم البيولوجيا الجزيئية من ذوي الخبرة لتحليل عينات متعددة حول 3-6 في دقيقة واحدة. ميزة فريدة من نوعها ليس فقط ممسحة يحسن الإنتاجية للقياس ، وأنه يقضي أيضا على الحاجة إلى التنظيف اليدوي من الركائز ، مما أدى إلى المرحل ضئيلة بين القياسات. وعلاوة على ذلك ، أشارت الاختبارات فقط باستخدام مناديل 2 لعينات من الحمض النووي يحتوي على 1000 نانوغرام / ميكرولتر ، المرحل أقل من 2 نانوغرام / ميكرولتر.

توافر خلية 5 ملم طول المسار يوفر خيارا لتحليل الحمض النووي وعينات من البروتين المخفف ويمتد استخدام هذه الأداة في التطبيقات الأخرى.

Disclosures

سجى سوكوماران على شهادة الدكتوراه ، وهو موظف في شيمادزو الذي يجعل الصك واردة في هذه المقالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpec-nano Shimadzu Corporation
Calf Thymus DNA Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. 4th edition, WILEY. (1999).
  2. Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).More

Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter