Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

doi: 10.3791/2699 Published: February 17, 2011

Summary

Deze mededeling bevat gegevens over de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de BioSpec-nano UV-VIS spectrofotometer voor dsDNA en eiwit kwantificatie. Zelfs met ultra-kleine volumes (1 tot 2 L), reproduceerbaarheid is uitstekend, terwijl de automatische vegen functie verbetert de doorvoer en resulteert in een minimale overdracht voor betere resultaten.

Abstract

Nucleic Acid kwantificatie procedures aanzienlijk gevorderd in de laatste drie decennia. Meer en meer, moleculair biologen nodig consistente klein-volume analyse van nucleïnezuur monsters voor hun experimenten. De BioSpec-nano biedt een mogelijke oplossing voor de problemen van onjuiste, niet-reproduceerbare resultaten, die inherent zijn aan de huidige DNA kwantificering methoden, via gespecialiseerde optica en een gevoelige PDA detector. De BioSpec-nano heeft ook geautomatiseerde functionaliteit zodanig dat montage-, meet-, en het schoonmaken worden gedaan door het instrument, zodat er geen vervelende, repetitieve, en inconsistente plaatsing van de glasvezel-element en handmatige reiniging.

In deze studie worden gegevens gepresenteerd over de kwantificering van DNA en eiwitten, evenals op metingen reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid. Geautomatiseerde monstervoorbereiding contact en een snelle scan kunnen de metingen in drie seconden, wat resulteert in uitstekende doorvoersnelheid. Data-analyse is uitgevoerd met behulp van de ingebouwde functies van de software. De formule voor het berekenen van DNA-concentratie is:

Voorbeeld Concentratie = DF · (OD260-OD320) · federatie (1)

Waar DF ​​= verdunningsfactor monster en de federatie = nucleïnezuur concentratie factor.

Het nucleïnezuur concentratie factor is ingesteld in overeenstemming met de analyt geselecteerde 1.

Eiwitconcentratie resultaten kunnen worden uitgedrukt in microgram / ml of in mol / L door het invoeren van e280 en waarden voor het molecuulgewicht respectievelijk. Bij het residu waarden voor Tyr, Trp en Cysteïne (SS obligatie) worden ingevoerd in de e280Calc tabblad, worden de extinctiecoëfficiënt waarden berekend als e280 = 5500 x (Trp residuen) + 1490 x (Tyr residuen) + 125 x (cysteïne SS bond) . De e280 waarde wordt gebruikt door de software voor de concentratie berekening.

Naast de concentratie bepaling van nucleïnezuren en eiwitten, kan de BioSpec-nano gebruikt worden als een ultra micro-volume spectrofotometer voor veel andere analyten of als een standaard spectrofotometer met behulp van 5 mm weglengte cellen.

Protocol

1. Procedure voor DNA Kwantificering

  1. Zet het instrument.
  2. Open de BioSpec-nano-software vanaf de PC bureaublad.
  3. Klik op de Simple Nucleic Acid-dsDNA tab (Figuur 1).
  4. De software zal de communicatie met het instrument en het uitvoeren van een initialisatie. Dit bevestigt dat het instrument presteert volgens de specificaties.
  5. Selecteer 0,7 of 0,2 mm op de weglengte slider. Hiermee selecteert u de weglengte en alle berekeningen zijn gebaseerd op de geselecteerde weglengte.
  6. Volgende in BioSpec-nano-software op Setup-Autowiping setup. Selecteer 1 of 2.
  7. Pipet 2 pi (voor 0,7 mm) H 2 O of buffer op het voetstuk.
  8. Klik op blanco of F6 voor de blanco meting. Iedere keer dat een nieuwe weglengte is geselecteerd is het noodzakelijk om het opnemen van een blanco.
  9. Pipetteer 2 pl van het monster op het voetstuk.
  10. Klik op Start in de software of druk op de startknop op het instrument. Het bovenste venster beweegt om contact te maken met het monster druppel. Xenon flitsers kunnen worden waargenomen.
  11. Herhaal hetzelfde monster drie keer om de reproduceerbaarheid te bepalen.
  12. Opgenomen alle gegevens worden opgeslagen als. Bud-bestand.
  13. Om op te slaan als een. Pdf of. CSV-bestand op te slaan klik op pdf / csv of F9. De resultaten kunnen ook worden opgeslagen als een. Csv-bestand met behulp van de juiste selectie in het tabblad Opslaan.

2. Protocol voor eiwit kwantificatie

  1. Kies Eiwit Kwantificering tabblad (figuur 2).
  2. Voer de extinctiecoëfficiënt e280, indien bekend.
  3. Als e280 is niet bekend berekenen met behulp van e280Calc.
  4. Selecteer 0,7 of 0,2 mm op de weglengte slider.
  5. Klik op Setup-Autowiping setup. Selecteer 2 of hoger.
  6. Pipetteer 3 pi (voor 0,2 mm) H 2 O of buffer op het voetstuk.
  7. Klik op blanco of F6 voor de blanco meting.
  8. Pipetteer 3 pi van eiwitmonster op het voetstuk.
  9. Klik op Start in de software of druk op de startknop op het instrument.
  10. Herhaal hetzelfde monster drie keer om de reproduceerbaarheid te bepalen.
  11. Opgenomen alle gegevens worden opgeslagen als. Bud bestand
  12. Om op te slaan als een. Pdf of. CSV-bestand op te slaan klik op pdf / csv of F9.

3. Representatieve resultaten:

1. Resultaten voor DNA Kwantificering

Figuur 3 toont de gegevens van metingen op een typische dubbelstrengs DNA monster. De concentratie en OD berekende 260/280 verhouding worden ook getoond. Figuur 4 bevat de reproduceerbaarheid testresultaten voor DNA kwantificering. De gegevens in de figuren 3 en 4 toont de resultaten in hoge mate reproduceerbaar zoals blijkt uit de lage relatieve standaardafwijking van 0,26%.

Opmerking 1:

Onnauwkeurigheid in DNA kwantificatie kan voortvloeien uit de aanwezigheid van buffer componenten die kunnen absorberen in het UV gebied. Het is ook nodig om een ​​homogeen monster oplossing te gebruiken. Naarmate de hoeveelheid monster gepipetteerd is slechts 1-2 uL, een zorgvuldige pipetteren van nauwkeurige volumes zonder invoering van een bubbels is vereist.

2. Resultaten voor eiwit kwantificatie

Figuur 5 geeft eiwitconcentratie analyse voor BSA. De ng / mL eiwitconcentratie is gebaseerd op de e280 waarde. Figuur 6 toont reproduceerbaarheid analyse. Het is duidelijk uit de relatieve standaarddeviatie van 0,51% dat de BioSpec-nano concentratie juist maatregelen - niet alleen voor DNA, maar ook voor eiwitten.

Opmerking 2: Factoren die van invloed eiwitconcentratie

Nauwkeurige bepaling van de concentratie eiwit is haalbaar als er minimale effecten van instabiliteit veroorzaakt door de pH, buffers, temperatuur, of additieven. De meeste gezuiverde eiwit doorloopt verschillende stappen van de verwerking, vandaar is het mogelijk dat het eiwit kan bevatten oppervlakteactieve stoffen of andere additieven die kunnen interfereren met druppelvorming. Voor deze monsters met behulp van de 5 mm weglengte kwarts cel wordt sterk aanbevolen.

Figuur 1
Figuur 1. Analyte selectievenster voor dubbelstrengs DNA kwantificering

Figuur 2
Figuur 2. Analyte selectie venster voor niet-gelabelde eiwitten kwantificatie

Figuur 3
Figuur 3. Vertegenwoordiger van gegevens voor DNA kwantificering

Figuur 4
Figuur 4. Reproduceerbaarheid van gegevens voor DNA kwantificering

Figuur 5
Figuur 5. Vertegenwoordiger van gegevens voor eiwit kwantificatie

"Afbeelding Figuur 6. Reproduceerbaarheid van gegevens voor eiwit kwantificatie

Discussion

De BioSpec-nano is ontworpen om de huidige problemen die inherent zijn aan DNA kwantificering methoden, zoals inconsistente resultaten en vervelend handenarbeid op te lossen. Elke meting duurt slechts drie seconden, zodat een ervaren moleculair bioloog aan ongeveer 3-6 meerdere monsters te analyseren in een minuut. Het unieke ruitenwisser-functie verbetert niet alleen de doorvoersnelheid van de meting, maar elimineert ook de noodzaak voor het handmatig reinigen van de voetstukken, wat resulteert in verwaarloosbare overdracht tussen de metingen. Bovendien, tests met slechts twee doekjes voor DNA-monsters die 1000 ng / ul, aangegeven overdracht minder dan 2 ng / ul.

De beschikbaarheid van een 5 mm weglengte cel biedt een mogelijkheid om te verdunnen nucleïnezuur en eiwit te analyseren en breidt het gebruik van dit instrument voor andere toepassingen.

Disclosures

Suja Sukumaran, PhD is een medewerker van Shimadzu, die maakt het instrument featured in dit artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpec-nano Shimadzu Corporation
Calf Thymus DNA Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. 4th edition, WILEY. (1999).
  2. Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).More

Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter