마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

Summary

의사 소통이 dsDNA와 단백질 quantitation에 대한 BioSpec - UV - VIS 나노 분광 광도계의 정확성과 재현성에 대한 데이터를 제공합니다. 자동 닦는 함수가 처리량과 더 정확한 결과를 위해 최소한의 carryover 결과를 개선하는 동안에도 초소형 볼륨 (1-2 패), 재현성이 우수합니다.

Abstract

핵산 quantitation 절차는 지난 30 년간 크게 고급 있습니다. 점점 더 많은, 분자 생물학 자들이 실험에 대한 핵산 샘플 일관성있는 작은 볼륨 분석을 필요로합니다. BioSpec - 나노는 전문 광학과 민감한 PDA 검출기를 통해 현재의 DNA quantitation 방법 고유의 부정확, 비 재현할 결과의 문제에 잠재적인 솔루션을 제공합니다. BioSpec - 나노도함으로써 광섬유 요소 및 수동 청소, 지루한 반복하고, 일관성없는 배치를 제거, 설치, 측정, 및 세척이 장비에 의해 수행되는 이러한 자동화된 기능이 있습니다.

본 연구에서는, 데이터는 DNA와 단백질뿐만 아니라 측정 재현성 및 정확도에의 부량에 제공됩니다. 자동 샘플 연락처 및 빠른 스캔 뛰어난 처리량의 결과, 3 초 안에 측정이 가능합니다. 데이터 분석 소프트웨어의 내장 기능을 사용 수행됩니다. DNA 농도를 계산에 사용되는 공식은 다음과 같습니다 :

샘플 농도 = DF ° (OD260 - OD320) · NACF (1)

= 샘플 희석 계수와 NACF = 핵산 농도 계수 어디 DF.

핵산 농도 계수는 ^1을 선택 analyte에 따라 설정됩니다.

단백질 농도 결과는 μg / ML 또는 각각 e280 및 분자량 값을 입력하여 몰스 / L로 표현할 수있다. 티르, TRP 그리고 시스테인 (SS 결합)에 대한 잔류 값이 e280Calc 탭에 입력하는 경우, 흡광 계수 값은 e280으로 계산됩니다 = 5,500 X (TRP의 잔류물) + 1490 X (티르의 잔류물) + 125 X (시스테인 SS 결합) . e280 값은 농도 계산을위한 소프트웨어에 의해 사용됩니다.

핵산과 단백질의 농도 결정뿐만 아니라, BioSpec - 나노는 다른 많은 analytes에 대한 매우 마이크로 볼륨 분광 광도계 또는 5mm의 pathlength 세포를 사용하여 표준 분광 광도계로 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. DNA의 Quantitation 절차

1. 악기를 켭니다.
2. PC의 바탕 화면에서 BioSpec - 나노 소프트웨어를 여십시오.
3. 간단한 핵산 - dsDNA 탭 (그림 1)를 클릭하십시오.
4. 소프트웨어 악기와 통신을 설정하고 초기화 순서를 실행합니다. 이것은 악기 사양에 따라 수행되었는지 확인합니다.
5. pathlength 슬라이더에서 0.7 또는 0.2 mm를 선택합니다. 이것은 pathlength를 선택하고 모든 계산이 선택 pathlength를 기반으로합니다.
6. BioSpec - 나노 소프트웨어 설치를 클릭 - Autowiping 설정에서 다음. 1 또는 2를 선택합니다.
7. 피펫 2 μL (0.7 mm)을 H ₂ O 또는 받침대에 버퍼.
8. 빈 측정 공백 또는 F6을 누릅니다. 새로운 pathlength 때마다 그것이 공백을 녹화하는 데 필요한 선택됩니다.
9. 받침대에있는 샘플의 피펫 2 μL.
10. 소프트웨어 시작하거나 악기의 시작 버튼을 누르면 클릭하십시오. 어퍼 창이 샘플 비말 접촉을 이동합니다. 제논 섬광을 볼 수 있습니다.
11. 재현성을 결정하기 위해 동일한 샘플에게 3 번 반복합니다.
12. 기록된 모든 데이터는. 버드 파일로 저장됩니다.
13. . PDF 또는. csv 파일로 저장하려면 PDF / CSV 또는 F9 저장을 클릭하십시오. 결과는 또한 저장 탭에서 적절한 선택을 사용하여. csv 파일로 저장할 수 있습니다.

2. 단백질 Quantitation을위한 프로토콜

1. 단백질 Quantitation 탭을 선택합니다 (그림 2).
2. 알려진 경우, 멸종 계수 e280을 입력합니다.
3. e280이 알려져 있지 않은 경우가 e280Calc를 사용하여 계산합니다.
4. pathlength 슬라이더에서 0.7 또는 0.2 mm를 선택합니다.
5. 설정 - Autowiping 설정을 클릭합니다. 2 선택하거나 위.
6. 피펫 3 μL (0.2 mm)을 H ₂ O 또는 받침대에 버퍼.
7. 빈 측정 공백 또는 F6을 누릅니다.
8. 페데 스탈에서 단백질 샘플의 피펫 3 μL.
9. 소프트웨어 시작하거나 악기의 시작 버튼을 누르면 클릭하십시오.
10. 재현성을 결정하기 위해 동일한 샘플에게 3 번 반복합니다.
11. 기록된 모든 데이터는. 버드 파일로 저장됩니다
12. . PDF 또는. csv 파일로 저장하려면 PDF / CSV 또는 F9 저장을 클릭하십시오.

3. 대표 결과 :

1. DNA의 Quantitation에 대한 검색 결과

그림 3은 전형적인 이중 좌초된 DNA 샘플에 대한 측정에서 데이터를 보여줍니다. 농도와 계산 OD 280분의 260 비율도 표시됩니다. 그림 4는 DNA의 quantitation에 대한 재현성 테스트 결과가 포함되어 있습니다. 그림 3 및 4 보여주는 결과의 데이터는 0.26 %의 낮은 상대 표준 편차에서 분명 같은 높은 재현할 수 있습니다.

주 1 :

의 DNA quantitation의 부정확은 자외선 영역에서 흡수 수 있습니다 버퍼 구성 요소의 존재에서 발생할 수 있습니다. 그것은 또한 동질적인 샘플 솔루션을 사용해야합니다. pipetted되는 샘플의 양이 어떤 거품의 도입없이 정확한 볼륨만이 1-2 μL, 조심 pipetting이므로 필요합니다.

2. 단백질 Quantitation에 대한 검색 결과

그림 5는 BSA에 대한 단백질 농도 분석을 나타냅니다. μg / ML 단백질 농도는 e280 가치에 기반을두고 있습니다. 그림 6은 재현성 분석을 보여줍니다. DNA뿐만 아니라 단백질을 위해뿐만 아니라 - 그것은 BioSpec - 나노 정확하게 농도를 측정하는 것을 0.51 %의 상대 표준 편차에서 분명하다.

2 주 : 단백질 농도에 영향을 미치는 요인

단백질의 정확한 농도 결정은 산도, 버퍼, 온도, 또는 첨가제에 의한 불안정성에서 최소한의 효과가있을 경우 가능합니다. 대부분의 단백질 정화 처리의 다양한 단계를 통해 이뤄지는, 따라서 그것은 단백질 비말 형성에 방해가 될 수있는 계면 활성제 또는 다른 첨가제를 포함할 수도 있습니다. 이러한 샘플은 5mm의 pathlength의 석영 세포를 사용하면 매우 좋습니다.

더블 좌초의 DNA quantitation를위한 그림 1. Analyte 선택 창

비 표시 단백질 quantitation에 대한 그림 2. Analyte 선택 창

DNA의 quantitation를위한 그림 3. 대표 데이터

DNA의 quantitation를위한 그림 4. 재현성 데이터

그림 5. 단백질 quantitation를위한 대표 데이터

그림 6. 단백질 quantitation에 대한 재현성 데이터

Discussion

BioSpec - 나노는 등 일관성없는 결과와 지루한 수동 노동의 DNA quantitation 방법 고유의 현재의 문제를 해결하기 위해 설계되었습니다. 각 측정 경험 분자 생물학이 분 3-6에 대한 여러 샘플을 분석할 수 있도록 불과 3 초 정도 걸립니다. 독특한 와이퍼 기능 측정의 처리량을 향상뿐만 아니라, 또한 측정 사이의 무시할 수 carryover의 결과로, 받침대의 수동 청소에 대한 필요성을 제거합니다. 또한, 1000 NG / μL를 포함하는 DNA 샘플에 대한 단 2 잎사귀를 사용하여 테스트, carryover을 표명 미만 2 μL / NG.

5mm의 pathlength 세포의 가용성 희석 핵산과 단백질 샘플을 분석하는 옵션을 제공하며 다른 응용 프로그램이 악기의 사용을 확장합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioSpec-nano	Shimadzu Corporation
Calf Thymus DNA	Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich