Summary
Questa comunicazione presenta i dati sulla precisione e la riproducibilità dei Biospec nano-UV-VIS per dsDNA e quantificazione delle proteine. Anche con ultra-piccoli volumi (da 1 a 2 L), la riproducibilità è eccellente, mentre la funzione automatica pulire migliora la velocità e si traduce in riporto minimo per ottenere risultati più precisi.
Abstract
Nucleic Acid procedure di quantificazione sono avanzati in modo significativo negli ultimi tre decenni. Sempre più, i biologi molecolari richiedono costante di piccoli volumi analisi dei campioni di acidi nucleici per i loro esperimenti. Il Biospec-nano fornisce una possibile soluzione ai problemi della inesatte, non riproducibili, inerenti gli attuali metodi di quantificazione del DNA, attraverso l'ottica specializzati e un rivelatore sensibile PDA. Il Biospec-nano dispone anche di funzionalità automatizzate in modo tale che il montaggio, la misura e la pulizia sono fatte dallo strumento, eliminando così il posizionamento noioso, ripetitivo, e incoerente l'elemento in fibra ottica e la pulizia manuale.
In questo studio, i dati vengono presentati sulla quantificazione di DNA e proteine, nonché la riproducibilità di misura e precisione. Contatto automatizzata dei campioni e la scansione rapida consente di misurare in tre secondi, con conseguente rendimento eccellente. L'analisi dei dati viene effettuata utilizzando il built-in caratteristiche del software. La formula utilizzata per calcolare la concentrazione del DNA è:
Concentrazione campione = DF · (OD260-OD320) · NACF (1)
Dove DF = fattore di diluizione del campione, NACF = fattore di concentrazione di acido nucleico.
Il fattore di concentrazione di acido nucleico è impostato secondo l'analita selezionato 1.
Risultati concentrazione di proteine può essere espressa come mg / ml o come moli / L inserendo E280 e valori di peso molecolare rispettivamente. Quando i valori di residui di Tyr, Trp e cisteina (SS obbligazioni) sono inseriti nella scheda e280Calc, i valori di estinzione coefficienti sono calcolati come E280 = 5500 x (residui Trp) + 1.490 x (residui Tyr) + 125 x (cisteina SS bond) . L'E280 valore viene utilizzato dal software per il calcolo della concentrazione.
Oltre alla determinazione della concentrazione di acidi nucleici e proteine, il Biospec-nano può essere usato come un ultra-micro volumi spettrofotometro per molti altri analiti o come uno spettrofotometro standard con 5 celle cammino ottico mm.
Protocol
1. Procedura per la quantificazione del DNA
- Accendere lo strumento.
- Aprire il Biospec-nano software dal desktop del PC.
- Clicca sul semplice Nucleic Acid-dsDNA scheda (Figura 1).
- Il software stabilire una comunicazione con lo strumento ed eseguire una sequenza di inizializzazione. Questo verifica che lo strumento sta eseguendo in base alle specifiche.
- Selezionare 0,7 o 0,2 mm sul cursore cammino ottico. Seleziona il cammino ottico e tutti i calcoli sono basati sul cammino ottico selezionato.
- Prossima Biospec-nano click software di installazione-Autowiping installazione. Selezionare 1 o 2.
- Pipettare 2 microlitri (per 0,7 mm) H 2 O o tampone sul piedistallo.
- Clicca vuoto o F6 per la misurazione vuoto. Ogni volta che un nuovo cammino ottico è selezionata, è necessario registrare un vuoto.
- Pipettare 2 ml di campione sul piedistallo.
- Fare clic su Start nel software o premere il pulsante di avvio sullo strumento. La finestra superiore si muove per prendere contatto con la goccia del campione. Flash allo xeno possono essere osservati.
- Ripetere lo stesso campione 3 volte a determinare la riproducibilità.
- Tutti i dati registrati vengono salvati come file. Bud file.
- Per salvare come file. Pdf o. Csv clicca salvare pdf / csv o F9. I risultati possono anche essere salvati come file. Csv utilizzando la selezione appropriata nella scheda Salva.
2. Protocollo per la quantificazione delle proteine
- Seleziona quantificazione scheda proteine (Figura 2).
- Inserire l'E280 coefficiente di estinzione, se è nota.
- E280 se non si sa calcolare usando e280Calc.
- Selezionare 0,7 o 0,2 mm sul cursore cammino ottico.
- Fare clic su Imposta-Autowiping installazione. Selezionare 2 o superiore.
- Pipettare 3 ml (per 0,2 mm) H 2 O o tampone sul piedistallo.
- Clicca vuoto o F6 per la misurazione vuoto.
- Pipettare 3 ml di campione di proteine sul piedistallo.
- Fare clic su Start nel software o premere il pulsante di avvio sullo strumento.
- Ripetere lo stesso campione 3 volte a determinare la riproducibilità.
- Tutti i dati registrati vengono salvati come file. Bocciolo di file
- Per salvare come file. Pdf o. Csv clicca salvare pdf / csv o F9.
3. Rappresentante dei risultati:
1. Risultati per la quantificazione del DNA
La figura 3 mostra i dati da misure su un tipico esempio di DNA a doppio filamento. La concentrazione e OD 260/280 rapporto calcolato sono mostrati. Figura 4 contiene la riproducibilità dei risultati di prova per la quantificazione del DNA. I dati in figure 3 e 4 mostra i risultati sono altamente riproducibili, come risulta dalla bassa deviazione standard relativa del 0,26%.
Nota 1:
Inesattezza quantificazione del DNA possono derivare dalla presenza di componenti del tampone che possono assorbire nella regione UV. E 'anche necessario utilizzare una soluzione omogenea del campione. Poiché la quantità di campione in pipettato è solo 1-2 microlitri, pipettaggio attento di volumi precisi senza introduzione di eventuali bolle è richiesto.
2. Risultati per la quantificazione delle proteine
La figura 5 rappresenta la concentrazione analisi delle proteine per BSA. La mg / ml concentrazione di proteine si basa sul valore E280. La figura 6 mostra l'analisi riproducibilità. E 'evidente dalla deviazione standard relativa del 0,51% che la Biospec-nano misura la concentrazione di precisione - non solo per il DNA, ma anche per le proteine.
Nota 2: Fattori che influenzano la concentrazione di proteine
Determinazione accurata della concentrazione di proteine è possibile quando ci sono effetti minimi di instabilità causata da pH, tamponi, la temperatura, o additivi. La maggior parte delle proteine purificate passa attraverso varie fasi di lavorazione e quindi è possibile che la proteina può contenere tensioattivi o altri additivi che possono interferire con la formazione di goccioline. Per tali campioni, utilizzando il percorso ottico 5 millimetri cellula quarzo è altamente raccomandato.
Figura 1. Analita finestra di selezione per la quantificazione del DNA doppio filamento
Figura 2. Finestra di selezione per la mancata quantificazione Analita proteina marcata
Dati Rappresentante Figura 3. Per la quantificazione del DNA
Dati Riproducibilità Figura 4. Per la quantificazione del DNA
Figura 5. Dati Rappresentante per la quantificazione delle proteine
Figura 6. Riproducibilità dei dati per la quantificazione delle proteine
Discussion
Il Biospec-nano è stato progettato per risolvere i problemi attuali inerenti i metodi di quantificazione del DNA, come i risultati inconsistenti e lavoro manuale noioso. Ogni misurazione dura solo 3 secondi, consentendo un esperto biologo molecolare per l'analisi circa 3-6 campioni multipli in un minuto. La caratteristica unica del tergicristallo non solo migliora il throughput di misura, elimina anche la necessità di pulizia manuale dei piedistalli, con conseguente riporto trascurabile tra le misurazioni. Inoltre, i test utilizzando solo 2 salviette per i campioni di DNA contenente 1000 ng / mL, indicato riporto inferiore a 2 ng / mL.
La disponibilità di una cella di 5 millimetri Lunghezza di percorso fornisce un'opzione per analizzare diluire campioni di acidi nucleici e proteine ed estende l'uso di questo strumento per altre applicazioni.
Disclosures
Suja Sukumaran, PhD è un dipendente di Shimadzu che rende lo strumento descritto in questo articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpec-nano | Shimadzu Corporation | ||
| Calf Thymus DNA | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich |
References
- Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. , 4th edition, WILEY. (1999).
- Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.
