Summary
我々は、細胞の捕獲と文化を可能にすることができるマイクロ流体デバイスの作製のためのプロトコルについて説明します。このアプローチではこのようなマイクロ流体チャネル内の溝のようなパターン化された微細構造は、セルがドッキングすることができる内に低せん断応力領域を作成するために使用されています。
Abstract
我々は、細胞の挙動を調べるためにmicrogroovedパターンを持つマイクロ流体デバイスを説明します。このマイクロ流体プラットフォームは、トップ流体チャネルおよび底microgrooved基板で構成されています。 microgroovedチャンネルを作製するために、マイクロ流体チャネルの印象を含む最上位ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）金型が整列しmicrogrooved基板に結合した。このデバイスを使用して、マウスの線維芽細胞は固定化とパターン化microgrooved基板内（25、50、75、および100μm幅）された。マイクロ流体デバイスのアポトーシスを研究するために、過酸化水素、アネキシンV、およびヨウ化プロピジウムを含むメディアは、2時間流路に灌流した。我々は酸化ストレスに曝された細胞がアポトーシスになったことがわかった。これらのアポトーシス細胞は、アポトーシスの過程で、原形質膜の外葉でホスファチジルセリンに結合することがアネキシンVにより確認した。 microgroovedパターンでこのマイクロ流体デバイスを用いて、アポトーシスのプロセスは、リアルタイムで観察し、インキュベーションチャンバー（37℃、5％CO 2）を含む倒立顕微鏡を用いて分析した。したがって、microgrooved基板が組み込まれたこのマイクロ流体デバイスは、細胞挙動を研究し、ハイスループット薬剤スクリーニングを行うために有用である可能性があります。
Protocol
マイクロ流体デバイスのA.の微細加工
- 4インチSiウエハーは、活性酸素プラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）で処理される。
- ネガ型フォトレジスト（SU - 8 2015、マイクロケム、MA）は、Siウエハ上に1分間900rpmでスピンコートです。
- ウェハは、ソフトは95で焼成° Cのホットプレート上で6分とマイクロチャネルを含むマスク膜を介して4分間UVライト（200W）にさらされている。
- ウェハは、95で焼成した後℃で6分間であり、SU - 8フォトレジストの現像剤を使用して開発されています。
- マイクロチャネルを含むフォトレジストパターン付きウェーハは、ペトリ皿に配置されます。
- ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）（Sylgard 184）金型は、混合シリコーンエラストマーと硬化剤（10:1比）によって製造される。
- PDMSの混合物は、Siマスターモールドに注ぎ、気泡を除去するため真空デシケーターに配置されます。
- PDMSは、1〜2時間、70℃で硬化させる。
- PDMSモールドは、その後のSiマスターモールドから剥離されています。
b.デバイスの組み立て
- 40μmの厚さのトップ流体チャネルと40μm厚の底microgroovedチャンネル（25、50、75、および100μメートル、幅）は、二つの異なるSiのマスター金型から取得されます。
- 流体デバイスのチャネル入口と出口がパンチされています。
- 流体チャンネルとマイクログルーブのチャンネルが不可逆的に活性酸素をプラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）によって接合される。
- 細胞外マトリックス（ECM）（すなわちフィブロネクチンは）インキュベーターで1時間（37℃）のためにマイクロ流体デバイスの内部にコーティングされています。
C.細胞播種と実験
- NIH - 3T3マウス線維芽細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いて組織培養フラスコで培養されています。
- 細胞はトリプシン処理し、解離する。
- 解離細胞を3の細胞密度× 10 6細胞/ ml（図1）におけるマイクログルーブのチャンネルにロードされます。
図1
- 2 mLのメディア、100mMのH 2 O 2、およびアポトーシスアッセイ（20μLのアネキシンVと40μLヨウ化プロピジウム、Invitrogen社、カリフォルニア州）は、シリンジポンプ（1μL/分）を使用してチャネルに注入されています。
- 細胞は倒立顕微鏡（ニコンTE 2000）を使用して監視し、リアルタイムです。
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Discussion
細胞は、マイクロ流体デバイスでmicrogrooved基板内に固定し、パターン化された。過酸化水素に曝露された細胞のアポトーシスの過程をリアルタイムで観察し、アネキシンVとヨウ化プロピジウムを用いて分析した。従って、マイクログルーブのチャンネルを含むこのマイクロ流体デバイスは、ハイスループット薬物スクリーニングのための役に立つかもしれません。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
