Summary
Xenopus ectoderm은 배아의 세포 극성의 연구에 대한 매력적인 모델이되고있다. 분석은 형광 단백질의 subcellular 배포는 ectoderm 세포에 과세되는, 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 신호의 공간적 제어 관련 주소 질문을하는 데 도움이됩니다.
Abstract
세포 극성 동적으로 배아 개발 1, 2 중 내장 및 외부 양쪽 요인에 의해 규제됩니다 진핵 세포의 기본 속성입니다. 이 규정에 관련된 신호 경로 중 하나는 embryogenesis 동안 여러 번 사용하고 인간의 질병에 3, 4, 5에 중요합니다 Wnt 경로입니다. 이 경로의 여러 분자 구성 요소는 coordinately 공간 제한 방식으로 신호를 통제하지만 기본 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. Xenopus 배아 상피 세포가 다양한 신호 단백질의 subcellular 지방화를 공부하는 우수한 시스템입니다. 형광등 융합 단백질은 RNA의 microinjection에 의해 Xenopus의 배아에서 표현, ectodermal의 explants 준비하고 단백질 지방화는 epifluorescence에 의해 평가됩니다. 이 실험 프로토콜에서 우리는 Diversin, 신호 및 세포 극성 결정 6, 7에 연루되어 세포질 단백질의 subcellular 지방화는 Wnt 신호 전달 8 공부 Xenopus ectodermal 세포의 시각이다 방법에 대해 설명합니다. Wnt 리간드 또는 Frizzled 수용체의 Coexpression 붉은 형광 단백질, RFP와 함께 융합 Diversin의 유통을 바꿀지도 모르겠어, 그리고 편광 패션 8, 9에있는 세포막에 모집. 이 전 생체내 프로토콜은 신호의 공간적 제어 손상 조직과는 다른 그리고 더 많은 어려운 분석되는 교양 포유 동물 세포의 체외 연구에서에 대한 유용한 이외해야합니다.
Protocol
Xenopus 계란 1.에서는 체외의 수정
- 실험 전에 인간 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (400 단위 / 개구리) 12 시간과 함께 주입했다 암컷 개구리의 알을 얻을 수 있습니다.
- 1 X 마크의 변경 링어 달걀 솔루션 (MMR) 10 해부 testis의 작은 조각으로 체외에서 그들을 비옥의 소량의 (0.5-1 ML)로 플레이스 계란. 2-3 분 후, 계란의 전체 표면을 커버하기 위해 0.1 X MMR을 추가합니다. HCL (수산화 나트륨과 산도 8 조정) - 20 분, 달걀 젤리 코트는 3 % 시스테인에 의해 제거됩니다. 계란은 주사에 대한 (13 ° C) 0.1 X MMR 세 번와 세탁과 감기 인큐베이터에 남아 있습니다.
- 수정된 달걀은 2-4 셀 단계 개발에 사용할 수 있습니다. 주사 들어, 배아는 3 % Ficoll, 0.5 X MMR을 포함하고있는 솔루션으로 전송됩니다.
2. RNA의 Microinjection
- RNAS는 mMessage mMachine 키트 (앰비온)를 사용하여 선형 DNA 템플릿에서 합성 및 0.1-1 μg / μl의 주식 농도에서 RNase 무료 물로 희석하고 있습니다. 주사에 대한 RNAS 최적의 복용은 파일럿 실험에서 결정됩니다. Diversin - RFP, 멤브레인 마커 GFP - CAAX 8 Frizzled에 대한 RNAS는 사출 당 0.1-1 NG에 사용됩니다.
- 주사 바늘은 바늘 연삭기와 다음 모세관과에서 바늘 풀러와 함께 준비하고 있습니다. 주입하기 전에 각각의 주사 바늘을 주입 액체 당 10 NL를 꺼내 물로 교정입니다.
- 주사 들어, 배아는 3 % Ficoll, 0.5 X MMR의 큰 비말에 플라스틱 접시에 게재됩니다. RNA 솔루션 중 하나 microliter은 Narishige microinjector과 주사 바늘로 빨려입니다. RNA 10 NL은 8 세포 배아 2-3 회 동물 blastomeres로 주입됩니다. 주입 배아는 12 잘 판의 우물에 전송됩니다.
3. 준비 Ectodermal의 Explants
- 주입된 배아가 초기 gastrula 단계에 도달하면, 그들은 1퍼센트 아가로 오스와 코팅 3cm 플라스틱 접시에 0.6 X MMR 솔루션으로 전송됩니다. Vitelline 막는 포셉 한 쌍의와 함께 수동으로 제거됩니다. Ectodermal의 explants은 텅스텐 바늘과 hairloop를 사용하여 배아에서 excised 수 있습니다.
- Ectodermal의 explants는 유리관에 양도와 인산 3.7 %의 포름 알데히드와 함께 고정 30 분 (PBS) 호수 버퍼입니다. 고정 explants는 PBS 세 번 (10 분마다)로 세탁합니다. DAPI는 핵을 얼룩이 세 번째 세척에 포함되어 있습니다.
- Explants은 슬라이드 유리에 장착된 있습니다. 스카치 테이프의 두 스트립은 슬라이드에 붙어 있으며, explants는 두 스트립 사이에 위치하고 있습니다. explants의 외부 표면에 색소 때문에, explants의 안쪽은 현미경의 목표를 직면한다. 장착 솔루션 11 (PBS 25 MG / ML DABCO, 변색 방지 시약을 포함하여 70 %의 글리세롤)의 2-3 20 μl 방울을 추가합니다. 위에 coverslip 놔.
4. 형광 현미경 Explants의 이미징
- 샘플은 적절한 필터를 자이스 혈구 Axioplan 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.
- 이미지가 여러 독립적인 explants에서 특정 비행기를 시각화하기 위해 Apotome 첨부 파일이 촬영됩니다.
5. Cryosectioning
Cryosectioning는 세포 및 immunostaining에 대한 더 적용에 형광 단백질의 분포를 시각적으로 대안적인 방법입니다. 10 단계에서 배아는 덴트의 정착액 (20 % DMSO, 80 % 메탄올)와 1-2시간에 대한 해결되었습니다 PBS로 씻어하고, 15 % 생선 gelatin/15 %의 자당 솔루션 11 내장. 임베디드 배아는 빠르게 드라이 아이스에 냉동하고 cryosections는 Leica 그라 이오 스탯에 생성됩니다. 크로스 섹션 주입 RNAS 및 번역된 단백질 제품을 상속 ectodermal 세포를 포함합니다. 섹션 형광 보유 및 특정 항체와 immunostained 후 형광과 복합 보조 항체로 분류하실 수 있습니다. 핵은 DAPI 물들일 수 있습니다. 설치 미디어는 위에서 설명한 것과 동일합니다. 위에서 설명한 영상을 수행할 수 있습니다.
6. 대표 결과 :
그림 1. Frizzled 수용체는 세포막에 Diversin을 모집. Frizzled 8 (Xfz8) 및 사업부 - RFP의 RNAS을 표현 Ectoderm 세포 대신의 세포막에서 사업부 - RFP를 공개 centrosome합니다 (G - tubulin의 공동 얼룩으로 나타났다). 실험의 계획은 상단에, 전형적인 단면이 표시됩니다.
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Discussion
우리는 Diversin의 subcellular 지방화를 특징으로 위의 프로토콜을 사용하고 있습니다. 동물 극 explants에서 Diversin - RFP는 핵 옆에 발견되었으며 cryosections (그림 1)에서 G - tubulin, centrosomal 마커와 colocalized. 단백질의 subcellular 지방화가 확인되면, 삭제 구조는 단백질 도메인이 필요하고 subcellular 지방화 충분되는 구축 생성할 수 있습니다. 이 방법을 사용 Diversin의 centrosomal 현지화 도메인은 중간에 매핑되었습니다과 단백질의 카르복시 - 터미널 도메인에 코일 - 코일 모티브 8 포함하는 둘 다.
동일한 프로토콜은 단백질 지방화는 신호에 대한 응답으로 변경되는, 연구에 사용할 수 있습니다. 우리는 Wnt 분비 단백질은 세포막에 인접한 작은 반점이있는 구조로 사업부 - RFP를 변경하는 행위 발견, 반면 세포막 패치 (그림 1) Fz8 모집 사업부 - RFP. 우리는 더욱 카르복시 - 터미널 도메인이 막 채용 라기보다는 필수 아니라는 것을 발견하지만, 편광 막 모집을 위해 필요합니다.
요약, 위의 실험 프로토콜은 단백질 - 단백질 상호 작용과 구체적인 성장 요인 또는 신호 단백질과 세포의 자극 후 다른 세포 구획에 단백질 지방화의 다양한 연구에 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
소콜 실험실에서 연구는 건강의 국가 Institues 후원됩니다.
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