Summary
Xenopus embriyonik ektoderm hücre polarite çalışmaları için cazip bir model haline gelmiştir. Bir tahlil floresan proteinlerin hücre içi dağıtım ektoderm hücreler değerlendirilir olduğu açıklanmıştır. Bu protokol adresi sorular sinyal mekansal kontrolü ile ilgili yardımcı olacaktır.
Abstract
Hücre polarite, dinamik, embriyonik gelişim 1, 2 sırasında hem içsel ve dışsal faktörler tarafından düzenlenir ökaryotik hücrelerin temel bir özelliğidir. Bu yönetmelikte yer alan sinyal yollarının Bir Wnt yolunun, embriyogenez sırasında pek çok kez kullandım ve insan hastalığı 3, 4, 5 için kritik. Bu yolun birden fazla moleküler bileşenleri koordineli bir mekansal sınırlı bir şekilde sinyal düzenleyen, ancak altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Xenopus embriyonik epitel hücreleri çeşitli sinyal proteinlerin hücre içi lokalizasyonu çalışmak için mükemmel bir sistemdir. Floresan füzyon proteinleri RNA mikroenjeksiyon Xenopus embriyolar ifade, ektodermal eksplantlar hazırlanır ve protein yerelleştirme Epifloresans tarafından değerlendirilir. Bu deney protokolünde Diversin, sinyalizasyon ve hücre polarite tayini 6, 7 karışmış olan bir sitoplazmik proteinin hücre içi lokalizasyonu Wnt sinyal iletimi 8 çalışma Xenopus ektodermal hücreler görüntülenmiştir nasıl açıklar. Wnt ligand veya Frizzled reseptör Koekspresyon kırmızı floresan proteini, RFP erimiş Diversin dağılımını değiştiren ve kutuplaşmış bir moda 8, 9, hücre zarındaki bu işe. Bu ex vivo protokolü yararlı bir ek sinyal mekansal kontrol, sağlam doku farklıdır ve analiz etmek için çok daha zor olduğu kültür memeli hücrelerinin, in vitro çalışmalar olmalıdır .
Protocol
1 Xenopus Yumurta Vücut Dışında Döllenme
- Deney insan koryonik gonadotropin (400 ünite / kurbağa) 12 saat önce enjekte edildi dişi kurbağa yumurta alın.
- 1 x Marc güncellenmiştir Zil yumurta solüsyonu (MMR) 10 ve disseke testis küçük bir parça ile in vitro döller küçük bir miktarı (0.5-1 ml) içine yerleştirin yumurta. 2-3 dakika sonra, yumurta tüm yüzeyini kaplayan 0,1 x MMR ekleyin. HCL (sodyum hidroksit ile pH 8 ayarlanabilir) - 20 dakika, yumurta jöle kat% 3 sistein tarafından kaldırıldı. Yumurta enjeksiyonları (13 ° C) 0,1 x MMR üç kez yıkanır ve soğuk bir inkübatör sol.
- Döllenmiş yumurtalar 2-4 hücre aşamasına geliştirmek için izin verilir. Enjeksiyonlar için, embriyoların% 3 Ficoll, 0.5 x MMR içeren çözüm aktarılır.
2. RNA Mikroenjeksiyon
- RNA'lar mMessage mMachine kiti (Ambion) kullanarak Lineerleştirilmiş DNA şablonlardan sentezlenmiş ve 0.1-1 mg / ml stok konsantrasyonu RNaz içermeyen su ile seyreltilir. Enjeksiyonlar için optimal doz RNA'lar pilot deneylerde belirlenir. Diversin RFP, membran işaretleyici GFP-CAAX ve 8 Frizzled RNA'lar enjeksiyon başına 0.1-1 ng kullanılır.
- Enjeksiyon iğneleri, sonra bir iğne değirmeni ve bir kılcal bir iğne çektirmenin ile hazırlanmıştır. Enjeksiyondan önce, her iğne sıvı enjeksiyon başına 10 nl çıkarmak için su ile kalibre edilir.
- Enjeksiyonlar için, embriyolar% 3 Ficoll, 0.5 x MMR büyük bir damlacık içine plastik bir kaba yerleştirilir. Bir RNA çözüm mikrolitrelik Narishige mikroenjektör bir enjeksiyon iğnesi içine emilir. RNA 10 nl, 8 hücreli embriyolar 2-3 kez hayvan blastomer içine enjekte edilir. 12 plaka bir kuyuya enjekte edilen embriyolar transfer edilir.
3. Hazırlanması Ektodermal eksplantlar
- Enjekte edilen embriyoların erken gastrula sahne ulaştığınızda, 0,6 x 3 cm plastik tabak% 1 agaroz ile kaplı bir MMR çözüm aktarılır. Vitellin membran forseps bir çift el ile kaldırılır. Ektodermal eksplantlar Tungsten iğne ve hairloop kullanarak embriyolardan eksize.
- Ektodermal eksplantlar bir cam şişenin içine aktarılır ve fosfat,% 3.7 formaldehit ile sabit 30 dakika tamponlu salin (PBS). Sabit eksplantlar PBS üç kez (her biri 10 dakika) ile yıkanır. DAPI çekirdekleri leke üçüncü yıkama dahil.
- Eksplantlarındaki bir slayt cam monte edilmiştir. Seloteyip iki şerit slayt eklenir ve eksplantları iki şeritler arasına yerleştirilir. Eksplant dış yüzeyi pigmentli olduğundan, eksplant iç tarafında mikroskop amacı bakmalıdır. Iki-üç montaj çözümü 11 (PBS 25 mg / ml DABCO, anti-solmaya reaktif de dahil olmak üzere% 70 gliserol) 20 ul damla ekleyin. Lamel üstüne koyun.
4. Floresan Mikroskop altında eksplant Görüntüleme
- Numuneler uygun filtreler ile Zeiss Axioplan floresan mikroskop altında görülüyor.
- Görüntüler belirli bir düzlemde birçok bağımsız eksplantlar görselleştirmek için Apotome eki ile alınır.
5. Cryosectioning
Cryosectioning floresan proteinlerin hücre ve immün için daha uygun dağıtım görselleştirmek için alternatif bir yol. Evre 10 embriyolar Dent fiksatif (% 20 DMSO,% 80 metanol) ile 1-2 saat boyunca sabit PBS ile yıkanır ve% 15 balık gelatin/15% sakaroz çözeltisini 11 gömülü. Gömülü embriyolar hızlı kuru buz üzerinde donmuş ve cryosections Leica Kriyostat üretilir. Kesitler enjekte RNA'lar ve tercüme protein ürünleri miras ektodermal hücreler içerir. Bölümleri floresan korumak ve spesifik antikorlar ile boyanmış ve ardından floresan ile konjuge sekonder antikor ile etiketli olabilir. Çekirdekler DAPI ile boyandı. Montaj medya yukarıda açıklandığı gibi aynıdır. Yukarıda açıklandığı gibi görüntüleme yapılabilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. Frizzled reseptör hücre zarı Diversin acemi Frizzled 8 (Xfz8) ve Div-RFP RNA'lar ifade Ektoderm hücreler yerine, hücre zarı Div-RFP ortaya centrosome (g-tubulin co-boyama ile ortaya). Deney düzen üst kısmında yer alır; tipik bir kesiti gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz Diversin hücre içi lokalizasyonu karakterize etmek için, yukarıdaki protokolünü kullandık. Hayvan kutup eksplantlar, Diversin-RFP çekirdeğin yanında tespit edildi ve cryosections (Şekil 1) g-tubulin, centrosomal işaretleyici, kolokalize. Bir proteinin hücre içi lokalizasyonu tespit edildikten sonra, silme yapıları, hücre içi lokalizasyonu için gerekli ve yeterli olan protein etki alanı kurmak için oluşturulabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, Diversin centrosomal yerelleştirme etki alanı ortasında eşlenmiş var ve proteinin karboksi-terminal alanları, sarım motifi içeren 8 hem.
Aynı protokolü protein yerelleştirme sinyalizasyon yanıt değişmiş olduğu, çalışmalarda kullanılabilir. Biz Wnt salgılanan proteinler, hücre zarı ile bitişik noktalı yapılara Div-RFP taşınmaya hareket ettiklerini, ancak FZ8 hücre zarı yamaları (Şekil 1) acemi Div-RFP. Biz daha membran işe başına karboksi-terminal etki alanı için gerekli olduğunu keşfetti, ancak polarize membran alımı için gerekli.
Özetle, yukarıdaki deney protokolünde protein-protein etkileşimleri ve protein spesifik büyüme faktörleri veya sinyal proteinleri hücre uyarılması sonra farklı hücre bölmeleri yerelleştirme çeşitli çalışmalarda yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Sokol laboratuvar Araştırma Ulusal Sağlık enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
References
- Gurdon, J. B. Embryonic induction --- molecular aspects. Development. 99, 285-306 (1987).
- Principles of Developmental Genetics. Moody, S. A. , Academic Press. (2007).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127, 469-480 (2006).
- Klaus, A., Birchmeier, W. Wnt signalling and its impact on development and cancer. Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).
- Gordon, M. D., Nusse, R. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).
- Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling. Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).
- Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).
- Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling. J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).
- Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development. Mech Dev. 74, 145-157 (1998).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30, 675-686 (1982).
- Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling. J Biol. 4, 3-3 (2005).
