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Biology

फ्लोरोसेंट प्रोटीन के Polarized में स्थानान्तरण Xenopus WNT सिगनल उत्तर में बाह्य त्वक स्तर

doi: 10.3791/2700 Published: May 26, 2011

Summary

Xenopus भ्रूण बाह्य त्वक स्तर सेल polarity के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल बन गया है. एक परख वर्णित है, जिसमें फ्लोरोसेंट प्रोटीन के subcellular वितरण बाह्य त्वक स्तर कोशिकाओं में मूल्यांकन किया है. इस प्रोटोकॉल पता संकेत के स्थानिक नियंत्रण से संबंधित प्रश्नों में मदद मिलेगी.

Abstract

सेल polarity यूकेरियोटिक कोशिकाओं है कि गतिशील रूप से भ्रूण विकास 1, 2 के दौरान दोनों आंतरिक और बाह्य कारकों द्वारा विनियमित की एक मौलिक संपत्ति है. संकेत इस विनियमन में शामिल रास्ते में से एक Wnt मार्ग है, जो embryogenesis दौरान कई बार प्रयोग किया जाता है और मानव रोग 3, 4, 5 के लिए महत्वपूर्ण है. इस मार्ग के एकाधिक आणविक घटकों coordinately एक spatially सीमित ढंग से संकेत विनियमित, लेकिन अंतर्निहित तंत्र को पूरी तरह समझ नहीं रहे हैं Xenopus भ्रूण उपकला कोशिकाओं विभिन्न संकेत प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम है.. प्रतिदीप्त संलयन प्रोटीन शाही सेना microinjection द्वारा Xenopus भ्रूण में व्यक्त कर रहे हैं, बहिर्जनस्तरीय explants तैयार कर रहे हैं और प्रोटीन स्थानीयकरण epifluorescence द्वारा मूल्यांकन किया है. हम इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में वर्णन कैसे Diversin है, एक cytoplasmic प्रोटीन है कि संकेत और सेल polarity के दृढ़ संकल्प 6, 7 में फंसा दिया गया subcellular स्थानीयकरण Xenopus बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं में visualized Wnt संकेत पारगमन 8 अध्ययन है . एक Wnt ligand या एक Frizzled रिसेप्टर के Coexpression लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, आरएफपी के साथ जुड़े हुए Diversin का वितरण बदल, और यह एक polarized 8 फैशन, 9 में कोशिका झिल्ली के लिए रंगरूटों. यह पूर्व vivo प्रोटोकॉल संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं, जिसमें संकेत के स्थानिक नियंत्रण बरकरार ऊतक के उस से अलग और अधिक विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है की इन विट्रो अध्ययन में एक के लिए उपयोगी इसके अतिरिक्त होना चाहिए .

Protocol

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1. Xenopus अंडे के इन विट्रो में निषेचन

  1. महिला मेंढ़क से अंडे कि मानव chorionic gonadotropin (400 इकाई / मेंढक) 12 घंटे के साथ प्रयोग से पहले अंतःक्षिप्त थे प्राप्त करते हैं.
  2. 1 एक्स मार्क संशोधित घंटी समाधान (एमएमआर) 10 अंडे के लिए और उन्हें dissected वृषण का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ इन विट्रो में खाद की एक छोटी राशि (0.5-1 एमएल) में प्लेस अंडे . 2-3 मिनट के बाद, 0.1 x MMR जोड़ने के लिए अंडे की पूरी सतह को कवर. एचसीएल (8 सोडियम हीड्राकसीड के साथ पीएच को समायोजित) - 20 मिनट में, अंडे जेली कोट 3% सिस्टीन द्वारा हटा दिया जाता है. अंडे 0.1 x MMR तीन बार के साथ धो रहे हैं और इंजेक्शन के लिए एक ठंडा इनक्यूबेटर में छोड़ दिया (13 डिग्री सेल्सियस).
  3. निषेचित अंडे 2-4 सेल चरण के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है. इंजेक्शन के लिए, भ्रूण 3% Ficoll, 0.5 x MMR युक्त समाधान में स्थानांतरित कर रहे हैं.

2. शाही सेना Microinjection

  1. RNAs linearized डीएनए mMessage mMachine किट (Ambion) का उपयोग कर खाके से संश्लेषित कर रहे हैं और 0.1-1 μg / μl के शेयर एकाग्रता में RNase मुक्त पानी के साथ पतला. पायलट प्रयोगों में RNAs के इंजेक्शन के लिए इष्टतम खुराक निर्धारित कर रहे हैं. Diversin आरएफपी, झिल्ली GFP-CAAX मार्कर और Frizzled 8 के लिए RNAs इंजेक्शन के प्रति 0.1-1 एनजी पर किया जाता है.
  2. इंजेक्शन सुइयों से एक केशिका और एक सुई चक्की के साथ तो एक सुई खींचने के साथ तैयार हैं. इंजेक्शन से पहले, प्रत्येक सुई पानी के साथ calibrated है तरल प्रति इंजेक्शन के 10 nl बेदखल करना है.
  3. इंजेक्शन के लिए भ्रूण पर 3% Ficoll, 0.5 x MMR की एक बड़ी छोटी बूंद एक प्लास्टिक पकवान में रखा जाता है. शाही सेना के समाधान का एक microliter Narishige microinjector के साथ एक इंजेक्शन सुई में चूसा है. शाही सेना के 10 nl 8 सेल 2-3 बार भ्रूण के पशु blastomeres में अंतःक्षिप्त है. इंजेक्शन भ्रूण के रूप में 12 अच्छी तरह से थाली के एक कुएँ में स्थानांतरित कर रहे हैं.

3. तैयारी बहिर्जनस्तरीय Explants

  1. जब इंजेक्शन भ्रूण जल्दी गेसट्रुला चरण तक पहुँचते हैं, वे एक 3 सेमी प्लास्टिक 1% agarose के साथ लेपित पकवान में 0.6 x MMR समाधान में स्थानांतरित कर रहे हैं. Vitelline झिल्ली मैन्युअल रूप से संदंश की एक जोड़ी के साथ हटा दिया जाता है. बहिर्जनस्तरीय explants से भ्रूण टंगस्टन सुई और hairloop का उपयोग excised हैं.
  2. बहिर्जनस्तरीय explants एक गिलास शीशी में स्थानांतरित कर रहे हैं और फॉस्फेट में 3.7% formaldehyde के साथ तय खारा (पीबीएस) के 30 मिनट के लिए बफर. पीबीएस तीन बार (10 मिनट प्रत्येक) के साथ फिक्स्ड explants धो रहे हैं. DAPI तीसरा नाभिक दाग धोने में शामिल है.
  3. Explants एक स्लाइड कांच पर बढ़ रहे हैं. स्कॉच टेप के दो स्ट्रिप्स स्लाइड से जुड़ी हैं और explants दो स्ट्रिप्स के बीच रखा जाता है. चूंकि explants की बाहरी सतह pigmented है, explants के भीतर की ओर खुर्दबीन उद्देश्य का सामना करना चाहिए. दो - तीन बढ़ते समाधान 11 (पीबीएस 25 मिलीग्राम / एमएल DABCO, विरोधी लुप्त होती अभिकर्मक सहित में 70% ग्लिसरॉल) के 20 μl बूँदें जोड़ें. शीर्ष पर coverslip रखो.

4. Explants की एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत इमेजिंग

  1. नमूने उपयुक्त फिल्टर के साथ Zeiss Axioplan फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे देखा जाता है.
  2. छवियाँ Apotome करने के लिए कई स्वतंत्र explants से एक विशेष विमान कल्पना अनुलग्नक के साथ लिया जाता है.

5. Cryosectioning

Cryosectioning के लिए सेल और immunostaining के लिए लागू में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का वितरण कल्पना के लिए एक वैकल्पिक तरीका है. चरण में 10, भ्रूण सेंध लगानेवाला (20% DMSO, 80% मेथनॉल) के साथ 1-2 घंटे के लिए तय कर रहे हैं, पीबीएस से धोया, और 15% मछली gelatin/15% sucrose 11 समाधान में एम्बेडेड. एम्बेडेड भ्रूण जल्दी सूखी बर्फ पर जमे हुए हैं और cryosections Leica cryostat पर उत्पन्न कर रहे हैं. क्रॉस वर्गों बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं है कि इंजेक्शन RNAs और उनके अनुवादित प्रोटीन उत्पादों वारिस शामिल होगा. वर्गों प्रतिदीप्ति बनाए रखने और विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunostained किया जा सकता है है और फिर माध्यमिक प्रतिदीप्ति साथ संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ लेबल. नाभिक DAPI के साथ दाग रहे हैं. बढ़ते मीडिया उसी के रूप में ऊपर वर्णित हैं. इमेजिंग के रूप में ऊपर वर्णित किया जा सकता है है.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1. Frizzled रिसेप्टर सेल झिल्ली Diversin रंगरूटों बाह्य त्वक स्तर Frizzled (Xfz8) 8 और डिव - आरएफपी RNAs व्यक्त कोशिकाओं के कोशिका झिल्ली पर डिव आरएफपी पता चलता है, के बजाय. Centrosome (के रूप में जी ट्यूबिलिन सह धुंधला हो जाना से पता चला). प्रयोग की योजना शीर्ष पर है, एक ठेठ पार अनुभाग में दिखाया गया है.

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Discussion

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हम ऊपर प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है Diversin के subcellular स्थानीयकरण विशेषताएँ है. जानवर पोल explants में, Diversin - आरएफपी नाभिक को बगल में खोजा गया था और जी - ट्यूबिलिन, cryosections (चित्रा 1) में एक centrosomal मार्कर के साथ colocalized. एक बार एक प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण की पहचान की है, विलोपन constructs स्थापित करने के लिए जो प्रोटीन डोमेन subcellular स्थानीयकरण के लिए आवश्यक और पर्याप्त हैं उत्पन्न किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, centrosomal स्थानीयकरण डोमेन Diversin के बीच किया गया प्रतिचित्रित है और प्रोटीन की carboxy टर्मिनल डोमेन में, दोनों coiled तार 8 आकृति युक्त .

एक ही प्रोटोकॉल अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसमें प्रोटीन स्थानीयकरण संकेत के जवाब में बदल दिया है. हमने पाया है कि Wnt secreted प्रोटीन कबरा कोशिका झिल्ली को आसन्न संरचनाओं के लिए डिव - आरएफपी स्थानांतरित अधिनियम, जबकि कोशिका झिल्ली पैच (चित्रा 1) Fz8 रंगरूटों डिव - आरएफपी. हम आगे पता चला कि carboxy टर्मिनल डोमेन झिल्ली भर्ती प्रतिशत से के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन polarized झिल्ली भर्ती के लिए आवश्यक है.

सारांश में, ऊपर प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और प्रोटीन विशिष्ट वृद्धि कारक या संकेत प्रोटीन के साथ कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद विभिन्न सेलुलर डिब्बों स्थानीयकरण के विभिन्न अध्ययनों में मदद मिलेगी.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

Sokol प्रयोगशाला में अनुसंधान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय institues द्वारा प्रायोजित है.

References

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फ्लोरोसेंट प्रोटीन के Polarized में स्थानान्तरण<em> Xenopus</em> WNT सिगनल उत्तर में बाह्य त्वक स्तर
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Itoh, K., Sokol, S. Y. Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling. J. Vis. Exp. (51), e2700, doi:10.3791/2700 (2011).More

Itoh, K., Sokol, S. Y. Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling. J. Vis. Exp. (51), e2700, doi:10.3791/2700 (2011).

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