Summary
여기에 단단한 판 기반식이 제한을 수행하는 프로토콜을 제시
Abstract
영양 부족이나 기아없이 음식 섭취의 감소가 수명을 증가시키고 포유 동물을 포함한 동물의 광범위한 다양한 연령과 관련된 질병의 발병을 지연하는 것으로 알려져 있습니다. 그것은 또한 체중과 불임의 감소뿐만 아니라 플라즈마 혈당, 인슐린, 이러한 동물의 IGF - 1의 낮은 수준을 초래합니다. 이 치료는 종종식이 제한 (DR) 또는 열량 제한 (CR)이라고합니다. 선충류의 Caenorhabditis의 엘레간스은 노화의 생물학을 공부에 대한 중요한 모델 생물로 등장했다. 환경과 유전 모두 조작이 모델 DR에 사용되고 있으며 C로 수명을 연장 보였습니다 엘레간스. 그러나, C로 보고된 DR 연구의 많은 엘레간스은 노화 분야에서 유전자 연구의 대부분은 배양 접시에서 표준 고체 한천에서 수행하는 동안, 액체 미디어 동물 전파에 의해 수행되었다. 여기 우리는 죽은 박테리아 표준 고체 NGM 한천 기반 판을 사용하여 DR 프로토콜을 제시한다.
Protocol
1. 세균 농도의 추정을위한 보정 곡선을 수립
이 섹션에서는 C로식이 제한 실험을위한 식품 소스로 사용되며 특정 박테리아 스트레인 (예 : OP50, HT115)의 세균 농도의 추정을위한 방법을 설명합니다 엘레간스. 별도의 교정 곡선은 응력이 사용 각각의 세균에 대해 설립해야합니다.
- E.의 단일 식민지의 예방 대장균 박테리아 OP50 3 ML 액체 LB의 국물에 LB 한천에 박테리아의 새로운 행진에서 골랐어요.
- 37 장소 OP50 문화 박테리아가 하룻밤 사이에 성장 ° C 뿌리와이 가능하다는 특징을 가지고있다.
- (2X, 4X, 8X, 16X, 32x) 야간 문화에서 세균성 정지 시리얼 2 배 dilutions를 준비합니다.
- 세중의에서 분광 광도계로 600 nm의 각 희석의 흡광도를 (광학 밀도) 측정.
- 또한 각각의 박테리아 현탁액 백만 배 (1000 배 희석 배) 희석.
- 100mm의 LB 한천 플레이트에 균등하게 각 희석의 세균성 정지 0.4 ML을 확산.
- 18~24시간에 대해 37 ° C 배양기에서 OP50와 장소 LB 번호판을.
- 각 접시에 박테리아 식민지 성장의 개수를 계산합니다. 식민지 카운트는 각 샘플에 대해 ML 당 cfu을 (콜로니 형성 단위)을 계산하는 데 사용됩니다.
- 측정된 OD 600 값을 OP50 세균 농도 사이의 관계는 세균의 농도 (cfu / ML)의 함수로 OD 600하려하고 선형 회귀 분석 (그림 1)을 수행하여 설치하실 수 있습니다.
솔루션 :
| Luria 맛을 (LB), 1L : | |
| 10g | Bacto - tryptone |
| 5g | 효모 추출 |
| 10g | NaCl |
1L에 탈이온수를 추가합니다.
압력솥과 실온에서 저장합니다.
2. 고체 판 기반식이 제한 (SDR) 접시의 준비
이 섹션은 고체 판을 기반으로식이 제한 (SDR) 실험에 사용하기 위해 접시의 준비에 대해 설명합니다. 일반적으로, 우리는 고려의 박테리아 농도 1 X 10 11 cfu / ML 광고 libitum 먹이 조건 1과 같은 X이 방법에 대한 최적의 DR 먹이 조건으로 10 8 cfu / ML. 그러나, 4-6 다른 박테리아의 농도는 SDR과 응답을위한 완벽한 복용량 종속적인 관계를 확립해야 할 수도 있습니다.
- E.의 단일 식민지의 예방 3 ML 액체 LB의 국물에 대장균 박테리아 OP50.
- 37 ° C 통에 OP50 문화를 삽입하여 박테리아가 6~8시간에 대한 성장 수 있습니다.
- 500 ML의 LB의 국물을 포함하는 새로운 플라스크에 OP50 문화를 전송하고, ° C 쉐이크 하루 37 다시 OP50 문화를 놓으십시오.
- 박테리아 농도 (농도가 파트 1에서 생성된 교정 곡선을 사용하여 계산)를 확인하기 위해 OP50 문화의 OD 600 측정. 적절한 dilutions는 흡광도의 정확한 측정에 필요한 수 있습니다.
- 20 분 1,500그램에서 원심 분리하여 펠렛 OP50 박테리아.
- 1 X 10 12 cfu / ML의 농도에 박테리아를 Resuspend.
- 여섯 가지 농도 10 ML 박테리아 문화를 준비 : 1 × 10 12 10 11 10 10 10 9 10 8 10 7 cfu / ML.
- 60mm의 중심에 박테리아 문화의 피펫 0.2 ML은 NGM 접시를 확정. 표면 닉스는 한천 플레이트에 버로우에 벌레를 허용 등 피펫 팁과 접시의 표면을 만지지 마십시오.
- 1 시간 동안 37 ° C 배양기에서 플레이스 번호판입니다.
- 박테리아의 성장을 체포하기 위해 각 플레이트에 100mg/mL carbenicillin과 50mg/mL kanamycin 10 μL의 10μL을 적용합니다.
- 4 항생제 - 살해 박테리아의 다른 농도 ° C 나중에 사용하기 위해 (최대 한 달). 함께 저장 플레이트 앞으로 적어도 1-2일 전체 계획의 실험을위한 충분한 접시를 준비하고 저장하는 것이 중요합니다. 전체 실험 접시 같은 배치를 이용하는 것은 바람직합니다.
- 박테리아의 생존을 확인하려면, SDR 번호판의 일부 박테리아를 긁어과 carbenicillin과 kanamycin과 빈 NGM 접시에 확산. 6~8시간에 대해 37 ° C 배양기에 플레이트를 삽입하고 박테리아의 성장 (어떤 박테리아의 성장이 관찰되지 않을 것입니다)를 확인하십시오.
솔루션
| 선충류 성장 미디어 (NGM), 1L : | |
| 3g | NaCl |
| 2.5 g | Bacto - 펩톤 |
| 20g | 한천 |
| 1 ML | 1 M MgSO 4 |
| 1 ML | 1 M CaCl 2 |
| 1 ML | 5 MG / ML 콜레스테롤 |
| 25 ML | 1M 칼륨 나트륨, 산도 6.0 |
즉시 10 ML의 aliquots의 60mm X 15mm 배양 접시에 액체 NGM를 따르다
3. SDR 실험 설정
이러한 수명 분석 및 불임 프로 파일링, 웜의 시대 - 동기 인구의 준비로 SDR 관련 연구의 대부분 필수적입니다. 다른 연구, 간단하게 식사 제한을 시작하는 SDR 판에 일반 OP50 접시에서 벌레를 전송합니다. 이 섹션에서는 SDR 동물에 대한 수명 분석을 설정하는 프로토콜은 예제로 설명되어 있습니다.
- OP50 여러 일반 NGM 플레이트에 20-30 reproductively 활성 성인 전송하는 플래티넘 웜 선택기를 사용하십시오. 실험에 필요한 난자의 숫자에 따라 더 많은 성인이 필요할 수 있습니다.
- ° C 4 시간 동안 달걀 누워 수 있도록 20 접시를 남겨주세요.
- 접시에서 어른을 제거합니다. 플레이트는 시각 달걀에 대한 검사를해야합니다.
- 20 접시를 남겨 ° C와 자손이 Late-L4/day 어른 1 단계로 발전 수 있습니다. 보통이 20 N2 야생 타입 웜 3 일이 소요 ° C.
- 식이 제한을 시작하는 SDR 플레이트에 1 일 성인의 적절한 숫자를 전송합니다.
- 수명 분석을 위해, 각 SDR 상태에 대한 번호판 10-20 벌레와 6-8 접시 총을 설정합니다.
- 모든 벌레가 죽었을 때까지 모든 이일 각 웜의 생존을 점수. 그것은 벌레가 음식의 완전한 박탈을 피하기 위해 모든 12-48시간 신선한 SDR 플레이트로 전송하는 것이 중요합니다.
4. 대표 결과 :
OD 600 관련 OP50 농도의 추정을위한 대표적인 보정 곡선의 줄거리는 그림 1에 표시됩니다. 라이너 회귀 분석에 의해 생성된 방정식은 OP50 세균 농도 이후의 모든 계산을 위해 사용될 수 있습니다. 그림 2에 표시된 것은 다른 웜 변종의 의미 수명에 만성 SDR 트리 트먼트의 효과를 시금의 예입니다. 파란색 라인은 SDR로 야생 타입의 웜의 보통사람들 종속적인 반응을 나타냅니다. DAF - 16 (mu86)는 SDR 유발 수명 연장에 아무런 영향을 미치지 않습니다 동안 빨간색 선은, SDR의 수명 효과가 부분적으로 drr - 2 오에 의해 억압을 나타냅니다. C.의 수명 분석을 수행하기위한 세부 방법 엘레간스은 이전 문학 1-3에 설명되어 있습니다.
그림 1. E.의 추정을위한 보정 곡선의 대표 결과 대장균 OP50 농도. OP50 농도가 측정된 OD 600 값을 함수로 꾸몄다 있습니다. 오차 막대 = SD 숙박 세균성 문화 흡광도 측정하기 전에, 4X, 2X, 1.5x 배속, 16 배속, 32x를 희석하고, 추가로 희석 1,000 X 번 cfu 측정하기 전에했습니다.
그림 2. C. 대표 결과 엘레간스 수명 실험은 (칭 외에서 그림 4.) SDR에 대한 응답으로 두 개의 서로 다른 돌연변이 (녹색과 빨간색)와 야생 유형 N2 동물 (파란색)을 비교. 오류 바 = SEM
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Discussion
식이 제한 (DR)는 수명을 증가시키고 5-7 포유 동물을 포함한 동물의 다양한 다양한 연령과 관련된 질병의 발병을 지연하는 것으로 알려져 있습니다. 환경과 유전 모두 조작은 C로 모델 DR에 사용되었습니다 세미 정의 액체 매질 8,9, 액체 배지에서 세균성 10-12 음식 소스의 희석하고, 느린 속도 13 행동 돌연변이 해당 피드의 사용 culturing 웜을 포함한 엘레간스. 액체 매체 culturing의 웜은 대부분의 웜 연구소에 의해 적응 고체 중간 플레이트 조건 다를 성장 조건을 포함 반면 그러나, DR 유전자의 모방은 DR 관련이없는 phenotypes을 생산 수 있습니다. 표준 단단한 접시에서 수행 DR 프로토콜 유용 것입니다 따라서 4,14,15 여러 그룹에 의해 개발되었습니다.
프로토콜이 여기에서 설명한에서 박테리아는 음식 섭취량의 수준을 제어하는 방법으로 접시에 두 가지 항생제를 적용하여 죽이고 있습니다. 그러나, 자외선 노출과 같은 대체 방법도 박테리아의 성장을 억제하는 데 사용할 수 있습니다.
SDR 실험 과정 중에 식품을 완전히 박탈 (즉, 기아)을 피하기 위해, 웜 단계 3.7에서 상기와 같은 모든 12-48시간 신선한 SDR 플레이트로 전송해야합니다. 전송 주파수는 음식 농도, 접시마다 웜의 번호 및 실험에 사용되는 웜 변종에 의해 만들어진 자식의 양에 따라 달라집니다. 예를 들어, 웜마다 48시간 20 살균 CF512을 양도 수 있습니다 [(b26) - 15 하기까지, fem - 1 (hc17)] 동물이 1 X 10 7 cfu / ML OP50 박테리아를 포함하는 SDR의 접시에 배치했다. 전송 빈도는 이전 SDR 플레이트가 세균 씨앗이 완전히 실험 조건에서 벌레에 의해 소비되기 전에 마지막 수 얼마나 오랫동안 실험에, 조사에 의해 결정되어야합니다. 비 멸균 변형과 함께 지난 몇 주간 (예 : 수명 분석)가, 50μg/ml FUDR은 계란이 누워 제거하기 위해 3.5 단계로 이전 SDR 플레이트에 추가할 수 수 실험을 수행할 때. 그렇지 않으면, 웜 훨씬 더 자주 그들의 자손에 의한 식품의 완전한 고갈을 피하기 위해 새로운 접시로 전송해야합니다.
판 당 20 개 이상의 동물을 배치, SDR 실험에서 판마다 배치 수있는 벌레의 수를에는 설정 제한은 없지만 SDR 처리를 다음과 수명 분석을위한 가능성을 채점에 어려움이 발생할 수 있습니다. 그것은 SDR은 성인의 1 일 빠르면 시작할 수도 주목할 가치가있다. 그러나, 초기 애벌레 단계에 SDR의 개시는 특정 상황에서 발달 체포의 원인이 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 A. - LH에 네이슨 쇼크 센터 (P30 AG13283)과 노화에있는 국립 연구소 (NIA)에서 R01 그랜트 (R01 AG028516)에서 파일럿 수상에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
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