Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Solid Plate-baserade dietrestriktioner i Caenorhabditis elegans Published: May 28, 2011 doi: 10.3791/2701

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra Plattor-baserade dietrestriktioner i

Abstract

Minskning av födointag utan undernäring eller svält är kända för att öka livslängd och fördröja uppkomsten av olika åldersrelaterade sjukdomar i ett brett spektrum av arter, inklusive däggdjur. Det orsakar också en minskning i kroppsvikt och fertilitet, samt lägre nivåer av plasmaglukos, insulin och IGF-1 hos dessa djur. Denna behandling är ofta som dietrestriktioner (DR) eller kalorimängden (CR). Nematoden Caenorhabditis elegans har vuxit fram som en viktig organism i forskningen för att studera åldrandets biologi. Både miljömässiga och genetiska manipulationer har använts för att modellera DR och har visat sig förlänga livslängden i C. elegans. Men många av de rapporterade DR studier i C. elegans gjordes av förökningsmaterial djur i flytande medier, medan de flesta av de genetiska studier på den åldrande fältet gjordes på den standard fast agar i petri plattor. Här presenterar vi ett DR-protokoll med vanliga fasta NGM agar-baserad plåt med dödade bakterier.

Protocol

1. Upprättande av en kalibreringskurva för uppskattning av bakterier koncentrationer

Detta avsnitt beskriver en metod för beräkning av bakterier koncentration för varje givet bakterietyp (t.ex. OP50, HT115) som kommer att användas som en näringskälla för dietrestriktioner experiment i C. elegans. Separata kalibreringskurvor bör fastställas för varje bakterier stam som använts.

  1. Inokulera en enda koloni av E. coli OP50 bakterier plockade från en ny strimma av bakterier på LB agar i 3 ml vätska LB buljong.
  2. Placera OP50 kultur i 37 ° C shaker och låta bakterier att växa över natten.
  3. Förbered seriella 2-faldigt spädningar av bakteriesuspensionen från natten kultur (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
  4. Mät absorbansen (optisk densitet) för varje utspädning vid 600 nm med spektrofotometern i tre exemplar.
  5. Ytterligare späd varje bakteriesuspension miljoner gånger (1000-faldig utspädning två gånger).
  6. Sprid 0,4 mL bakteriesuspension av varje spädning jämnt fördelat på en 100 mm LB agarplatta.
  7. Placera LB plattor med OP50 i ett 37 ° C inkubator för 18-24 timmar.
  8. Räkna antalet kolonier som odlas på varje platta. De kolonier används för att beräkna cfu (kolonibildande enheter) per ml för varje prov.
  9. Förhållandet mellan uppmätta OD 600 värden och OP50 bakterier koncentrationer kan fastställas genom att rita OD 600 som funktion av bakteriell koncentration (cfu / ml) och utför en linjär regressionsanalys (Figur 1).

Lösningar:

Luria buljong (LB), 1L:
10 g Bacto-Tryptone
5 g Jästextrakt
10 g NaCl

Tillsätt avjoniserat vatten till 1L.
Autoklav och förvara i rumstemperatur.

2. Beredning av solid plåt-baserade dietrestriktioner (SDR) plattor

Detta avsnitt beskriver Beredning av plattorna för användning i fasta plattan baserade dietrestriktioner (SDR) experiment. Normalt anser vi en bakterie koncentration av 1 x 10 11 cfu / ml ad lib utfodring skick och 1 x 10 8 cfu / ml som den optimala DR utfodring förutsättning för denna metod. Dock krävs 4-6 olika bakterier koncentrationer behövas för att fastställa en komplett dosberoende förhållande till SDR och dess svar.

  1. Inokulera en enda koloni av E. Coli OP50 bakterier i 3 ml vätska LB buljong.
  2. Placera OP50 kultur i 37 ° C shaker och låta bakterier att växa i 6-8 timmar.
  3. Överför OP50 kulturen till en ny kolv som innehåller 500 buljong ml LB, och placera OP50 kulturen bakåt i 37 ° C shaker över natten.
  4. Mät OD 600 av OP50 kulturen att bestämma bakterier koncentration (koncentrationen beräknas med hjälp av kalibreringskurvan genereras i del 1). Lämpliga spädningar kan behövas för en noggrann mätning av absorbans.
  5. Pellets OP50 bakterier genom centrifugering vid 1500 g under 20 minuter.
  6. Resuspendera bakterier till en koncentration på 1 x 10 12 cfu / ml.
  7. Förbered 10 ml bakteriekultur i sex olika koncentrationer: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 cfu / ml.
  8. Pipettera 0,2 ml bakteriekultur i mitten av en 60 mm stelnat NGM plattan. Undvik att vidröra ytan av plattan med pipettspetsen, eftersom hack på ytan tillåter maskar att krypa in i agarplattor.
  9. Placera plattorna i 37 ° C inkubator i 1 timme.
  10. Applicera 10μL av 100mg/ml Carbenicillin och 10 mikroliter av 50mg/mL kanamycin att varje platta för att gripa tillväxten av bakterier.
  11. Förvara plattor med olika koncentrationer av antibiotika dödas-bakterier vid 4 ° C för framtida användning (upp till en månad). Det är viktigt att förbereda och lagra tillräckligt plåtar för hela den planerade experiment minst 1-2 dagar framåt. Med samma parti plattor för hela experimenten är att föredra.
  12. För att verifiera livskraft bakterier, skrapa vissa bakterier ur SDR tallrikar och sprida det på en tom NGM tallrik med Carbenicillin och kanamycin. Placera plattan i 37 ° C inkubator för 6-8 timmar och kontrollera sedan för tillväxt av bakterier (ingen bakterietillväxt bör observeras).

Lösningar

Nematod Tillväxt Media (NGM), 1L:
3 g NaCl
2,5 g Bacto-Peptone
20g Agar
ove_content "> Autoklav i 40 minuter och låt svalna till 65 ° C, lägg sedan till:

1 ml 1 M MgSO 4
1 ml 1 M CaCl 2
1 ml 5 mg / ml Kolesterol
25 ml 1M kaliumfosfat, pH 6,0

Omedelbart hälla flytande NGM på 60 mm x 15 mm petriskålar i 10 ml alikvoter

3. Ställa in SDR experiment

För de flesta av SDR-liknande studier, såsom livslängd analys och fertilitet profilering, utarbetande av en ålder synkroniserad-population av maskar är viktigt. För andra studier, att helt enkelt överföra maskar från en vanlig OP50 platta till en SDR tallrik att inleda dietrestriktioner. I detta avsnitt är ett protokoll för att upprätta en livslängd analys för SDR djur som beskrivs som ett exempel.

  1. Använd en plockare platina mask för att överföra 20-30 reproduktivt aktiva vuxna på flera regelbundna NGM tallrikar med OP50. Beroende på antalet ägg som krävs för försök får fler vuxna att behövas.
  2. Låt plattorna vid 20 ° C i 4 timmar så att äggläggning.
  3. Ta bort de vuxna från plattan. Plattor ska inspekteras visuellt för ägg.
  4. Låt plattorna vid 20 ° C och låta avkomman utvecklas till Late-L4/day 1 vuxen skede. Vanligtvis tar detta 3 dagar för N2 vilda typer maskar vid 20 ° C.
  5. Överför ett lämpligt antal dag 1 vuxna på SDR plattan att inleda dietrestriktioner.
  6. För en livslängd analys, inrätta sammanlagt 6-8 tallrikar med 10-20 maskar per platta för varje SDR skick.
  7. Betyg lönsamheten för varje mask varje 2 dagar tills alla maskarna har dött. Det är viktigt att maskarna ska överföras till nya SDR-plattor var 12-48 timmar för att undvika fullständig berövande av mat.

4. Representativa resultat:

Visas i figur 1 är en tomt på en representativ kalibreringskurva för uppskattning av OP50 koncentration i förhållande till OD 600. Ekvationen som genereras av liner regressionsanalys kan användas för alla framtida beräkningar av OP50 bakterier koncentrationer. Visas i figur 2 är ett exempel på testmetoder för effekten av kronisk SDR behandlingar innebär livslängden för olika mask stammar. Den blå linjen representerar en normal dosberoende respons av vild-typ maskar till SDR. Den röda linjen visar att livslängden effekten av SDR delvis hämmas av katastrofförebyggande-2 oe, medan DAF-16 (mu86) har ingen effekt på SDR-inducerad livslängd förlängning. Detalj metod för att utföra livslängd analys i C. elegans beskrivs i tidigare litteratur 1-3.

Figur 1
Figur 1. Representativt resultat av en kalibreringskurva för uppskattning av E. Coli OP50 koncentration. OP50 koncentration ritas som en funktion av uppmätta OD 600 värden. Felstaplar = SD Övernattning bakteriekultur späddes 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x innan absorbans mätning och spädas ytterligare 1000 x två gånger innan CFU mätning.

Figur 2
Figur 2. Representativt resultat av ett C. elegans livslängd experiment jämföra vilda djur typ N2 (blå) med två olika mutanter (grön och röd) som svar på SDR (Bild från Ching et al. 4). Felstaplar = SEM

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dietrestriktioner (DR) är känd för att öka livslängd och fördröja uppkomsten av olika åldersrelaterade sjukdomar i ett brett spektrum av arter, inklusive däggdjur 5-7. Både miljömässiga och genetiska manipulationer har använts för att modellera DR i C. elegans, inklusive odling maskar i en semi-definierat flytande medium 8,9, utspädning av den bakteriella föda i flytande medium 10-12, och användning av beteenden mutanter som foder i en långsammare takt 13. Dock får genetisk härmar DR producerar fenotyper som inte är relaterade till DR, medan odling maskar i ett flytande medium innebär tillväxt villkor som skiljer sig från fast substrat plattan villkor som är anpassade efter de flesta mask laboratorier. En DR-protokoll som utförs på vanliga solida plattor skulle vara bra och därför har tagits fram av flera grupper 4,14,15.

I protokollet beskrivs här, är att bakterierna dödas genom att använda två olika antibiotika på plattorna som ett sätt att kontrollera graden av födointag. Dock kan alternativa metoder, såsom UV-exponering också användas för att förhindra bakterietillväxt.

För att undvika fullständig berövande av mat (dvs svält) under SDR experiment, maskar måste överföras till nya SDR-plattor var 12-48 timmar som nämns i steg 3,7. Frekvensen av överföringen beror på maten koncentration, antalet maskar per platta, och mängden avkomma som produceras av masken stam som används i experimentet. Till exempel kan maskar överlåtas var 48 timmar vid 20 sterila CF512 [fer-15 (B26), FEM-1 (hc17)] djur placerades på en SDR tallrikar med 1 x 10 7 cfu / ml OP50 bakterier. Frekvensen av överföringen ska bestämmas genom att undersöka, innan experimentet, hur länge SDR plattorna kan pågå innan seedade bakterier är helt konsumeras av maskar under experimentella förhållanden. När man utför experiment att pågå i flera veckor (t.ex. livslängd analys) med en icke-steril stam kan 50μg/ml FUDR läggas till SDR plattor innan steg 3,5 för att eliminera äggläggningen. Annars kommer maskar måste överföras till nya plåtar mycket oftare för att undvika fullständig utarmning av mat på grund av deras avkomma.

Medan det finns ingen gräns på antalet maskar som kan placeras per platta i en SDR experiment, att placera mer än 20 djur per platta kan orsaka svårigheter i att göra poäng lönsamhet för en livslängd analyseras med de SDR behandlingen. Det är också värt att notera att SDR kan inledas så tidigt som dag 1 av vuxenlivet. Dock kan initiering av SDR i tidiga larvstadier orsakar gripandet under vissa omständigheter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av en pilot utmärkelse från Nathan Shock Center (P30 AG13283) och en R01 bidrag (R01 AG028516) från National Institute on Aging (NIA) till A.-LH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin Duchefa Biochemie C0109.25 Dissolved in water.
Kanamycin Roche Group 10106801001 Dissolved in water.
Bacto-peptone BD Biosciences DF0118072
Bacto-tryptone BD Biosciences DF0123075
Bacto-yeast extract BD Biosciences DF0127071
Agar BD Biosciences DF00145170
Sterile culture tube USA Scientific, Inc. 1485-0810
Spectrophotometer Amersham Gene Quant pro Amersham is now part of GE Healthcare.
Dissecting Microscope Carl Zeiss, Inc. Stemi 2000
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Accuspin FR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
  2. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
  3. Apfeld, J., Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature. 402, 804-809 (1999).
  4. Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9, 545-557 (2010).
  5. Weindruch, R., Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , Thomas. (1988).
  6. Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).
  7. Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).
  8. Houthoofd, K. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).
  9. Houthoofd, K. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).
  10. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
  11. Bishop, N. A., Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature. 447, 545-549 (2007).
  12. Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature. 447, 550-555 (2007).
  13. Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).
  14. Kaeberlein, T. L. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5, 487-494 (2006).
  15. Greer, E. L. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).

Tags

Utvecklingsbiologi dietrestriktioner kalorimängden C. elegans livslängd
Solid Plate-baserade dietrestriktioner i<em> Caenorhabditis elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ching, T., Hsu, A. Solid Plate-based More

Ching, T., Hsu, A. Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (51), e2701, doi:10.3791/2701 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter