Summary
هنا نطرح على بروتوكول لتنفيذ لوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في
Abstract
ومن المعروف الحد من تناول الطعام من دون سوء التغذية أو المجاعة لزيادة العمر وتأخير ظهور الأمراض المرتبطة بالعمر المختلفة في مجموعة واسعة من الأنواع ، بما فيها الثدييات. كما أنه يسبب انخفاض في وزن الجسم والخصوبة ، وكذلك انخفاض مستويات السكر في البلازما ، والانسولين ، وIGF - 1 في هذه الحيوانات. وكثيرا ما يشار إلى هذا العلاج وتقييد الغذائية (DR) أو الحد من السعرات الحرارية (CR). برزت ايليجانس انواع معينة الخيطية باعتبارها كائن نموذجا هاما لدراسة بيولوجيا الشيخوخة. وقد استخدمت التلاعب الناحيتين البيئية والوراثية للدكتور النموذجية وأظهرت لتمديد عمر في C. ايليجانس. ومع ذلك ، فإن العديد من الدراسات التي أعلن عنها في DR C. تم القيام به عن طريق الترويج ايليجانس الحيوانات السائل في وسائل الإعلام ، في حين تم القيام به معظم الدراسات الوراثية في مجال الشيخوخة على أجار الصلبة القياسية في لوحات بتري. هنا نقدم بروتوكول DR باستخدام معيار الصلبة NGM آغار المستندة وحة مع البكتيريا قتل.
Protocol
1. إنشاء منحنى المعايرة لتقدير تركيزات البكتيريا
هذا المقطع يصف طريقة لتقدير تركيز البكتيريا عن أي سلالة بكتيريا معينة (مثلا OP50 ، HT115) التي سيتم استخدامها كمصدر للغذاء للتجارب تقييد الغذائية في C. ايليجانس. وينبغي وضع منحنيات المعايرة منفصلة لكل سلالة البكتيريا المستخدمة.
- تلقيح مستعمرة واحدة من E. اختار القولونية OP50 البكتيريا من مسحة جديدة من البكتيريا على أجار LB في 3 مل مرق LB السائل.
- مكان OP50 الثقافة في 37 درجة مئوية شاكر وتسمح للبكتيريا لتنمو بين عشية وضحاها.
- يعد المسلسل 2 أضعاف التخفيفات لتعليق البكتيرية من الثقافة بين عشية وضحاها (2X ، 4X ، 8X ، 16X ، 32x).
- قياس الامتصاصية (الكثافة البصرية) من كل تخفيف في 600 نانومتر بواسطة معمل في ثلاث نسخ.
- مزيد من تمييع كل تعليق البكتيرية 1000000 أضعاف (1000 أضعاف التخفيف مرتين).
- 0.4 مل من انتشار البكتيريا من كل تعليق تخفيف بالتساوي على طبق آجار LB 100 ملم.
- مكان لوحات LB مع OP50 في الحاضنة 37 درجة مئوية ل18-24 ساعة.
- حساب عدد المستعمرات البكتيرية نمت على كل لوحة. وتستخدم التهم مستعمرة لحساب CFU (وحدة مستعمرة تشكيل) لكل مليلتر لكل عينة.
- يمكن تأسيس العلاقة بين القيم المقاسة و600 OD OP50 تركيزات البكتيريا عن طريق التآمر OD 600 كدالة للتركيز البكتيريا (كفو / مل) ، وإجراء تحليل الانحدار الخطي (الشكل 1).
الحلول :
| مرق لوريا (LB) ، 1L : | |
| 10 ز | Bacto - تريبتون |
| 5 ز | مستخلصات الخميرة |
| 10 ز | كلوريد الصوديوم |
يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 1L.
الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد لوحة الصلبة القائمة على النظام الغذائي لوحات (SDR) تقييد
هذا المقطع يصف إعداد لوحات لاستخدامها في بناء لوحة الصلبة الغذائية التجارب (SDR) التقييد. عادة ، نرى تركيز البكتيريا من 1 × 10 11 كفو / مل كما بالمال وبالشهرة أيضا إعلان حالة التغذية و1 × 10 8 كفو / مل كشرط الأمثل لتغذية DR هذا الأسلوب. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة 4-6 تركيزات مختلفة البكتيريا لإقامة كاملة الجرعة التي تعتمد على العلاقة لحقوق السحب الخاصة واستجاباته.
- تلقيح مستعمرة واحدة من E. القولونية OP50 البكتيريا في 3 مل من السائل مرق LB.
- وضع الثقافة في 37 OP50 شاكر درجة مئوية وتسمح للبكتيريا لتنمو لمدة 6-8 ساعات.
- نقل ثقافة OP50 إلى قارورة جديدة تحتوي على 500 مل مرق LB ، ووضع الثقافة في OP50 الظهر 37 درجة مئوية شاكر بين عشية وضحاها.
- قياس OD 600 من ثقافة OP50 لتحديد تركيز البكتيريا (ويحسب تركيز باستخدام منحنى المعايرة ولدت في الجزء 1). قد تكون هناك حاجة التخفيفات المناسبة لقياس دقيق للالامتصاصية.
- بيليه OP50 البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 1500 ز لمدة 20 دقيقة.
- Resuspend البكتيريا إلى تركيز 1 × 12 10 كفو / مل.
- تحضير 10 مل الثقافة البكتيريا في ستة تركيزات مختلفة : 1 × 10 12 ، 10 11 ، 10 10 ، 10 9 ، 10 8 ، 10 7 كفو / مل.
- طدت ماصة 0.2 مل من ثقافة البكتيريا في وسط لوحة NGM 60 ملم. تجنب لمس سطح اللوحة مع تلميح ماصة ، والنكات على سطح تسمح لتحفر الديدان في لوحات أجار.
- لوحات مكان في 37 حاضنة درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تطبيق 10μL من كربنيسيلين 100mg/mL و 10 ميكرولتر من الكاناميسين 50mg/mL إلى كل لوحة لإلقاء القبض على نمو البكتيريا.
- لوحات تخزين مع تركيزات مختلفة من البكتيريا للمضادات الحيوية في قتل 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل (حتى شهر واحد). من المهم إعداد وتخزين ما يكفي من لوحات لتجربة المخطط بأكمله على الأقل 1-2 أيام المقبلة. باستخدام نفس دفعة من لوحات للتجارب بأكملها هو الأفضل.
- للتحقق من صلاحية البكتيريا ، وتتخلص من بعض أنواع البكتيريا من حقوق السحب الخاصة لوحات وانتشاره على صفيحة فارغة مع NGM كربنيسيلين والكاناميسين. وضع لوحة في 37 حاضنة درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات ومن ثم تحقق لنمو البكتيريا (وينبغي ملاحظة أي نمو البكتيريا).
الحلول
| الديدان الخيطية وسائط النمو (NGM) ، 1L : | |
| 3 ز | كلوريد الصوديوم |
| 2.5 غرام | Bacto - ببتون |
| 20G | آغار |
| 1 مل | 1 م MgSO 4 |
| 1 مل | 1 م 2 CaCl |
| 1 مل | 5 ملغ / مل نسبة الكولسترول في الدم |
| 25 مل | 1M فوسفات البوتاسيوم ، 6.0 درجة الحموضة |
صب السائل على الفور NGM 60 ملم × 15 ملم في أطباق بتري aliquots 10 مل
3. إعداد تجارب حقوق السحب الخاصة
بالنسبة لمعظم دراسات حقوق السحب الخاصة ذات الصلة ، مثل تحليل مدى الحياة والتنميط الخصوبة ، وإعداد السكان في سن متزامنة من الديدان أمر ضروري. لدراسات أخرى ، ونقل ببساطة الديدان من لوحة OP50 منتظمة لحقوق السحب الخاصة لوحة لبدء تقييد الغذائية. في هذا المقطع ، يتم وصف بروتوكول لاقامة عمر تحليل للحيوانات حقوق السحب الخاصة على سبيل المثال.
- استخدام منتقي الدودة البلاتين لنقل 20-30 البالغين التناسل النشطة على عدة لوحات NGM منتظمة مع OP50. اعتمادا على عدد من البيض المطلوبة للتجارب ، قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من الكبار.
- ترك لوحات عند 20 درجة مئوية لمدة 4 ساعات للسماح للوضع البيض.
- إزالة لوحة من البالغين. وينبغي لوحات تفقد البصر عن البيض.
- ترك لوحات عند 20 درجة مئوية ، والسماح للذرية لتطوير الكبار في Late-L4/day المرحلة 1. عادة ، وهذا يستغرق 3 أيام لأنواع الديدان N2 البرية عند 20 درجة مئوية.
- نقل عدد مناسب من البالغين 1 يوم حقوق السحب الخاصة على لوحة لبدء تقييد الغذائية.
- لتحليل عمر ، تعيين ما يصل الى 6-8 مع لوحات في لوحة 10-20 الديدان لكل حالة حقوق السحب الخاصة.
- درجة قابلية كل دودة كل يوم 2 حتى عن الديدان لقوا حتفهم. فمن الأهمية بمكان أن يتم نقل الديدان لحقوق السحب الخاصة لوحات جديدة كل ساعة 12-48 لتجنب الحرمان الكامل من الطعام.
4. ممثل النتائج :
هو مبين في الشكل رقم 1 هو مؤامرة ممثل منحنى المعايرة لتقدير OP50 تركيز فيما يتعلق OD 600. ويمكن استخدام المعادلة المتولدة عن تحليل الانحدار بطانة لجميع الحسابات في المستقبل تركيزات البكتيريا OP50. هو مبين في الشكل 2 مثالا على معايرة تأثير العلاجات المزمنة حقوق السحب الخاصة على عمر يعني سلالات دودة مختلفة. الخط الأزرق يمثل طبيعية تعتمد على الجرعة استجابة البرية من نوع الديدان لحقوق السحب الخاصة. الخط الأحمر يشير إلى أن قمعت جزئيا تأثير عمر من حقوق السحب الخاصة التي DRR - 2 عمر الفاروق ، في حين DAF - 16 (mu86) ليس له تأثير على تمديد عمر حقوق السحب الخاصة التي يسببها. الطريقة بالتفصيل لأداء تحليل عمر في C. ايليجانس يوصف في الأدبيات السابقة 1-3.
الشكل 1. الممثل نتيجة لمنحنى المعايرة لتقدير E. القولونية OP50 التركيز. يتم رسم OP50 تركيز بوصفها وظيفة من 600 OD قياس القيم. أشرطة الخطأ وتخفيفه SD = ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها 8X 1.5x ، 2X ، 4X ، 16X ، 32x قبل قياس الامتصاصية ، وكذلك 1000 X المخفف مرتين قبل CFU القياس.
الشكل 2. الممثل نتيجة لجيم ايليجانس عمر التجربة المقارنة بين الحيوانات البرية N2 نوع (الأزرق) مع اثنين من المسوخ مختلفة (الأخضر والأحمر) استجابة لحقوق السحب الخاصة (من الشكل تشينغ وآخرون 4). أشرطة الخطأ = SEM
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومن المعروف تقييد الغذائية (DR) لزيادة العمر وتأخير ظهور الأمراض المرتبطة بالعمر المختلفة في مجموعة واسعة من الأنواع ، بما فيها الثدييات 5-7. وقد استخدمت التلاعب الناحيتين البيئية والوراثية للدكتور النموذج في C. ايليجانس ، بما فيها الديدان زراعة في وسط شبه السائلة 8،9 المعرفة ، التخفيف من مصدر الغذاء البكتيرية في السائل المتوسط 10-12 ، واستخدام السلوك المسوخ التي تتغذى بمعدل أبطأ 13. ومع ذلك ، قد يقلد الوراثية الدكتور انتاج الظواهر التي لا علاقة لها DR ، في حين أن زراعة الديدان في وسط السائل ينطوي على شروط النمو التي تختلف عن ظروف لوحة متوسطة الصلبة تكييفه من قبل معظم المختبرات دودة. ومن شأن تنفيذ بروتوكول الدكتور على لوحات الصلبة القياسية تكون مفيدة ، وبالتالي فقد وضعت عدة مجموعات 4،14،15.
في البروتوكول وصفها هنا ، ويقتل البكتيريا عن طريق تطبيق two المضادات الحيوية المختلفة لوحات كوسيلة للتحكم في مستوى الاستهلاك الغذائي. ومع ذلك ، يمكن أيضا طرق بديلة مثل التعرض للأشعة فوق البنفسجية يمكن استخدامها لمنع البكتيريا النمو.
لتجنب الحرمان من الغذاء الكامل (أي الموت جوعا) خلال التجارب حقوق السحب الخاصة ، والديدان الحاجة إلى تحويلها إلى لوحات جديدة من حقوق السحب الخاصة في كل ساعة 12-48 على النحو المذكور أعلاه في الخطوة 3.7. تردد لنقل يعتمد على تركيز المواد الغذائية ، وعدد من الديدان في لوحة ، وكمية من النسل التي تنتجها دودة السلالة المستخدمة في التجربة. على سبيل المثال ، يمكن أن تنتقل الديدان كل 48 ساعة عند 20 CF512 العقيمة [فر 15 (B26) ؛ فيم - 1 (hc17)] وضعت على لوحات الحيوانات حقوق السحب الخاصة التي تحتوي على 1 × 10 7 كفو / مل OP50 البكتيريا. وينبغي أن تحدد وتيرة نقل عن طريق فحص ، قبل التجربة ، وكيف طويلة لوحات حقوق السحب الخاصة قد الأخيرة قبل ويستهلك تماما المصنف البكتيرية التي الديدان تحت ظروف تجريبية. عند إجراء التجارب التي تستمر عدة اسابيع (مثل عمر تحليل) مع سلالة غير معقمة ، يمكن أن تضاف إلى لوحات 50μg/ml FUDR حقوق السحب الخاصة قبل الخطوة 3.5 للقضاء على وضع البيض. وإلا فإن الديدان لا بد من تحويلها إلى لوحات جديدة في كثير من الأحيان أكثر من ذلك بكثير لتجنب استنفاد كامل من المواد الغذائية نظرا لأبنائهم.
بينما قد لا يوجد حد أقصى لعدد الديدان التي يمكن وضعها في لوحة في تجربة حقوق السحب الخاصة ، ووضع اكثر من 20 لوحة لكل الحيوانات يسبب صعوبة في تسجيل جدوى لتحليل عمر بعد العلاج حقوق السحب الخاصة. ومن الجدير بالذكر أيضا أن يمكن البدء من حقوق السحب الخاصة اعتبارا من يوم 1 من سن البلوغ. ومع ذلك ، قد بدء من حقوق السحب الخاصة في مراحل اليرقات المبكر سبب اعتقال التنموية في ظروف معينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة التجريبية من مركز الصدمات ناثان (P30 AG13283) ومنحة R01 (R01 AG028516) من المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) إلى A. - LH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature. 402, 804-809 (1999).
- Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9, 545-557 (2010).
- Weindruch, R., Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , Thomas. (1988).
- Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).
- Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).
- Houthoofd, K. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).
- Houthoofd, K. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Bishop, N. A., Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature. 447, 545-549 (2007).
- Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature. 447, 550-555 (2007).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).
- Kaeberlein, T. L. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5, 487-494 (2006).
- Greer, E. L. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
