Summary
Hier presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van solide plaat op basis van dieetbeperking in
Abstract
Vermindering van de voedselinname, zonder ondervoeding of honger is bekend dat de levensduur te verhogen en het begin van verschillende leeftijd gerelateerde ziekten in een breed scala aan soorten, waaronder zoogdieren vertraging. Het veroorzaakt ook een afname in lichaamsgewicht en de vruchtbaarheid, maar ook lagere niveaus van plasma glucose, insuline en IGF-1 in deze dieren. Deze behandeling wordt vaak aangeduid als calorische restrictie (DR) of calorische restrictie (CR). De nematode Caenorhabditis elegans heeft zich ontpopt als een belangrijk modelorganisme voor het bestuderen van de biologie van veroudering. Zowel de milieu-en genetische manipulaties zijn gebruikt om het model DR en hebben aangetoond dat de levensduur te verlengen in C. elegans. Echter, veel van de gerapporteerde DR studies in C. elegans werden gedaan door het propageren van dieren in vloeibare media, terwijl de meeste van de genetische studies in de verouderende gebied werden gedaan op de standaard solide agar in petri-platen. Hier presenteren wij een DR-protocol met behulp van standaard solid NGM agar-based bord met gedode bacteriën.
Protocol
1. Tot vaststelling van een ijklijn voor de raming van bacteriën concentraties
Dit hoofdstuk beschrijft een methode voor de schatting van de concentratie bacteriën voor een bepaalde bacteriën stam (bijv. OP50, HT115), die zal worden gebruikt als een voedselbron voor Dieetbeperking experimenten in C. elegans. Aparte kalibratiecurves moeten worden vastgesteld voor elke bacteriën stam gebruikt.
- Inoculeren een enkele kolonie van E. coli-bacteriën OP50 geplukt van een verse streep van bacteriën op LB-agar in 3 ml vloeibare LB bouillon.
- Plaats OP50 cultuur in 37 ° C mogelijk maakt shaker en bacteriën om te groeien 's nachts.
- Bereid seriële 2-voudige verdunningen van de bacteriële schorsing van het 's nachts cultuur (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- Meet de extinctie (optische dichtheid) van elke verdunning bij 600 nm door de spectrofotometer in drievoud.
- Verder vul telkens bacteriesuspensie miljoen-voudige (1000-voudige verdunning tweemaal).
- Spreiding 0,4 ml bacteriële suspensie van elke verdunning gelijkmatig op een 100 mm LB agar plaat.
- Plaats LB-platen met OP50 in een 37 ° C incubator voor 18-24 uur.
- Tel het aantal bacteriële kolonies gegroeid op elk bord. De kolonie telt worden gebruikt om kve (kolonievormende eenheid) per mL te berekenen voor elk monster.
- De relatie tussen de gemeten OD 600-waarden en OP50 bacteriën concentraties kunnen worden vastgesteld door het plotten van OD 600 als een functie van bacteriële concentratie (cfu / ml) en het uitvoeren van een lineaire regressie analyse (figuur 1).
Oplossingen:
| Luria Broth (LB), 1L: | |
| 10 g | Bacto-trypton |
| 5 g | Gist Extract |
| 10 g | NaCl |
Voeg gedeïoniseerd water aan 1L.
Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur.
2. Bereiding van vaste plaat op basis van calorische restrictie (SDR) platen
Dit gedeelte beschrijft de bereiding van platen voor gebruik in vaste-plaat op basis van calorische restrictie (SDR) experimenten. Normaal gesproken, vinden we een bacterie concentratie van 1 x 10 11 cfu / ml als de ad libitum voeren conditie en 1 x 10 8 CFU / ml als de optimale DR voeden voorwaarde voor deze methode. Echter, 4-6 mei verschillende bacteriën concentraties nodig zijn om een volledige dosis-afhankelijke relatie voor SDR en de reacties vast te stellen.
- Inoculeren een enkele kolonie van E. Coli-bacteriën in OP50 3 ml vloeibare LB bouillon.
- Plaats de OP50 cultuur in 37 ° C shaker en laat de bacteriën om te groeien voor 6-8 uur.
- Breng de OP50 cultuur tot een nieuwe kolf met 500 ml LB-bouillon, en terug plaatsen van de OP50 cultuur in 37 ° C shaker 's nachts.
- Meet de OD 600 van de OP50 cultuur om de bacteriën concentratie (de concentratie wordt berekend met behulp van de ijkcurve gegenereerd in deel 1) te bepalen. Van geschikte verdunningen kan nodig zijn voor een nauwkeurige meting van absorptie.
- Pellet OP50 bacteriën door centrifugeren bij 1500 g gedurende 20 minuten.
- Resuspendeer bacteriën om een concentratie van 1 x 10 12 cfu / ml.
- Bereid 10 ml bacteriecultuur in zes verschillende concentraties: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 cfu / ml.
- Pipetteer 0,2 ml van bacteriën cultuur in het midden van een 60 mm gestold NGM plaat. Vermijd het aanraken van het oppervlak van de plaat met pipetpunt, zoals inkepingen op het oppervlak wormen laten ingraven in de agar platen.
- Plaats platen in 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Van toepassing zijn 10μL van 100mg/ml carbenicilline en 10 pi van 50mg/mL kanamycine om elke plaat om de groei van de bacteriën te arresteren.
- Store platen met verschillende concentraties van antibiotica-gedode bacteriën bij 4 ° C voor toekomstig gebruik (tot een maand). Het is belangrijk om voor te bereiden en genoeg platen op te slaan voor de gehele geplande experiment ten minste 1-2 dagen vooruit. Met behulp van de dezelfde partij platen voor de gehele experimenten is de voorkeur.
- Te controleren of de levensvatbaarheid van de bacteriën, schraap sommige bacteriën uit de SDR borden en verdeel het op een lege NGM plaat met carbenicilline en kanamycine. Plaats de plaat in 37 ° C incubator gedurende 6-8 uur en controleer vervolgens voor de groei van de bacteriën (geen groei van bacteriën moeten in acht worden genomen).
Oplossingen
| Nematoden Groei Media (NGM), 1L: | |
| 3 g | NaCl |
| 2,5 g | Bacto-Pepton |
| 20g | Agar-agar |
| 1 mL | 1 M MgSO 4 |
| 1 mL | 1 M CaCl 2 |
| 1 mL | 5 mg / ml Cholesterol |
| 25 ml | 1M kaliumfosfaat, pH 6,0 |
Onmiddellijk Giet vloeibaar NGM op 60 mm x 15 mm petrischalen in 10 ml aliquots
3. Het opzetten van experimenten SDR
Voor de meeste van de SDR-gerelateerde studies, zoals de levensduur analyse en vruchtbaarheid profilering, de voorbereiding van een leeftijd-gesynchroniseerde bevolking van wormen is essentieel. Voor andere studies, alleen de overdracht van wormen uit een reguliere OP50 plaat om een SDR plaat om de calorische restrictie te starten. In dit gedeelte is een protocol om het opzetten van een levensduur analyse voor SDR dieren omschreven als een voorbeeld.
- Gebruik een platina worm picker tot 20-30 Reproductief actieve volwassenen op een aantal reguliere NGM platen overdracht met OP50. Afhankelijk van het aantal eieren die nodig zijn voor de experimenten, kan meer volwassenen nodig zijn.
- Laat de platen bij 20 ° C gedurende 4 uur om eieren leggen.
- Haal de volwassenen uit de plaat. De platen moeten visueel worden geïnspecteerd op eieren.
- Laat de platen bij 20 ° C en laat het nageslacht te ontwikkelen in de Late-L4/day een volwassen stadium. Meestal is dit duurt 3 dagen voor N2 wilde soorten wormen bij 20 ° C.
- Overdracht van een geschikt aantal dagen een volwassenen op SDR plaat om de calorische restrictie te starten.
- Voor een levensduur analyse, het opzetten van een totaal van 6-8 platen met 10-20 wormen per plaat voor elke SDR conditie.
- Score de levensvatbaarheid van elke worm om de 2 dagen totdat alle wormen zijn gestorven. Het is cruciaal dat de wormen worden overgedragen aan verse SDR platen om 12-48 uur in beslag onthouding van voedsel te voorkomen.
4. Representatieve resultaten:
Weergegeven in figuur 1 is een plot van een representatieve ijklijn voor de schatting van de OP50-concentratie in verhouding tot OD 600. De vergelijking die door liner regressie-analyse kan worden gebruikt voor alle toekomstige berekeningen van OP50 bacteriën concentraties. Weergegeven in figuur 2 is een voorbeeld van het testen van het effect van chronische BTR behandelingen op de gemiddelde levensduur van de verschillende stammen worm. De blauwe lijn vertegenwoordigt een normale dosis-afhankelijke respons van de wild-type wormen naar SDR. De rode lijn geeft aan dat de levensduur effect van SDR gedeeltelijk wordt onderdrukt door DRR-2 oe, terwijl de daf-16 (mu86) heeft geen effect op de SDR-geïnduceerde levensduur extensie. Detail methode voor het uitvoeren levensduur analyse in C. elegans is beschreven in de voorgaande literatuur 1-3.
Figuur 1. Vertegenwoordiger resultaat van een kalibratie-curve voor de raming van E. Coli OP50 concentratie. OP50 concentratie is uitgezet als functie van de gemeten OD 600 waarden. Foutbalken = SD Overnight bacteriële cultuur werd verdund 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x voor absorptie meting, en verder verdund 1000 x twee keer eerder cfu meting.
Figuur 2. Vertegenwoordiger gevolg van een C. elegans levensduur experiment vergelijken van wild-type N2 dieren (blauw) met twee verschillende mutanten (groen en rood) in reactie op de SDR (figuur uit Ching et al.. 4). Foutbalken = SEM
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieetbeperking (DR) is bekend dat de levensduur te verhogen en het begin van verschillende leeftijd gerelateerde ziekten vertraging in een breed scala aan soorten, waaronder zoogdieren 5-7. Zowel de milieu-en genetische manipulaties zijn gebruikt om het model DR in C. elegans, waaronder het kweken van wormen in een semi-gedefinieerde vloeibaar medium 8,9, verdunning van de bacteriële voedselbron in vloeibaar medium 10-12, en het gebruik van het gedrag van mutanten die zich voeden in een trager tempo 13. Kan echter genetische nabootsers van DR produceren fenotypen die niet gerelateerd zijn aan DR, terwijl het kweken van wormen in een vloeibaar medium gaat de groei omstandigheden die afwijken van het vaste medium plaat voorwaarden aangepast door de meeste worm laboratoria. Een DR protocol uitgevoerd op standaard massieve platen zou nuttig zijn en derhalve is ontwikkeld door verschillende groepen 4,14,15.
In het protocol hier beschreven, worden de bacteriën gedood door toepassing van twee verschillende antibiotica aan de platen als een manier om het niveau van de voedselinname te controleren. Kunnen echter alternatieve methoden, zoals UV-blootstelling ook worden gebruikt om de groei van bacteriën te remmen.
Om te voorkomen dat volledige onthouding van voedsel (bijvoorbeeld honger) in de loop van SDR experimenten, wormen moeten worden overgezet op vers SDR platen iedere 12-48 uur, zoals hierboven vermeld in stap 3.7. De frequentie van de overdracht is afhankelijk van de voeding de concentratie, het aantal wormen per plaat, en de hoeveelheid van de nakomelingen van de worm stam gebruikt in het experiment. Kan bijvoorbeeld wormen worden overgedragen elke 48 uur bij 20 steriele CF512 [fer-15 (B26), FEM-1 (hc17)] dieren werden geplaatst op een SDR platen met 1 x 10 7 cfu / ml OP50 bacteriën. De frequentie van de overdracht moet worden bepaald door te onderzoeken, voorafgaand aan het experiment, hoe lang de SDR-platen zou kunnen duren voordat de zaadjes bacteriële volledig wordt verbruikt door de wormen onder experimentele omstandigheden. Bij het uitvoeren van experimenten die laatste paar weken (bijv. levensduur analyse) met een niet-steriele stam, 50μg/ml FUDR kunnen worden toegevoegd voorafgaand aan de SDR platen tot 3,5 stap te elimineren eieren leggen. Anders zal wormen moeten worden overgedragen aan verse platen veel vaker om volledige uitputting van voedsel als gevolg van hun nakomelingen te voorkomen.
Hoewel er geen vaste limiet op het aantal wormen dat kan per plaat worden geplaatst in een SDR experiment, het plaatsen van meer dan 20 dieren per plaat kan leiden tot problemen in het scoren van de levensvatbaarheid van een levensduur analyse na de SDR behandeling. Het is ook vermeldenswaard dat SDR kan worden gestart vanaf dag 1 van de volwassenheid. Kan echter begin van de SDR in een vroeg larvale stadia ontwikkelingsstoornissen veroorzaken arrestatie in bepaalde omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een piloot prijs van de Nathan Shock Center (P30 AG13283) en een R01-subsidie (R01 AG028516) van het National Institute on Aging (NIA) naar A.-LH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature. 402, 804-809 (1999).
- Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9, 545-557 (2010).
- Weindruch, R., Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , Thomas. (1988).
- Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).
- Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).
- Houthoofd, K. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).
- Houthoofd, K. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Bishop, N. A., Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature. 447, 545-549 (2007).
- Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature. 447, 550-555 (2007).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).
- Kaeberlein, T. L. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5, 487-494 (2006).
- Greer, E. L. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
